肝細胞癌患者血漿循環DNA的定量分析及臨床意義

冉貴萍，黃 海，楊國珍＊，郭 鵬，袁 勇

（1.貴陽醫學院檢驗系，貴州貴陽550004；2.上海奉賢區奉城醫院，上海201411）

肝細胞癌患者血漿循環DNA的定量分析及臨床意義

冉貴萍1，2，黃 海1，楊國珍1＊，郭 鵬2，袁 勇2

（1.貴陽醫學院檢驗系，貴州貴陽550004；2.上海奉賢區奉城醫院，上海201411）

目的 定量檢測肝細胞癌（HCC）患者血漿循環DNA（cf－DNA）含量，探討其在原發性肝癌早期診斷及病情監測中的臨床應用價值。方法 收集40例肝細胞癌、30例代償期肝硬化、20例活動性肝炎和25例正常健康對照血漿，提取血漿循環DNA，采用real－time實時熒光定量PCR方法檢測β－actin基因的表達，確定血漿循環DNA的水平。結果 HCC組、肝硬化組、肝炎組和健康對照組中位血漿循環DNA濃度分別為17.090ng／ml、8.182ng／ml、7.447 ng／ml和9.014ng／ml，HCC組和健康對照組循環DNA水平比較有顯著性差異（P＜0.05）；肝硬化組、肝炎組和健康對照組比較無顯著性差異（P＞0.05），ROC曲線分析表明血漿循環DNA水平能夠區分肝癌和健康人（AUC＝0.8450），以循環DNA水平11.92ng／ml作為診斷HCC的臨界值，其診斷的特異度是84.0%，敏感度是72.5%。血漿cf－DNA濃度與AFP聯合檢測可以將HCC診斷率提高至77.5%。結論 real time PCR技術可精確定量血漿循環DNA濃度，檢測血漿中循環DNA含量可作為診斷和監測原發性肝癌指標的有效補充。

肝細胞癌；循環DNA；實時熒光定量PCR

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0918）

早期診斷是原發性肝癌獲得早期治療的前提，肝癌有強大的代償能力，早期常無癥狀，這給肝癌的早期診斷帶來一定的困難，因此，尋找外周血腫瘤標記是臨床上亟需解決的一個難題。另外，對肝癌術后患者復發進行有效監測也是控制肝癌，提高生存率的關鍵［1－3］。循環無細胞DNA（circulating cellfree DNA，cf－DNA）是存在于血清和血漿中的游離DNA，近年研究表明［4－7］，腫瘤在生長過程中持續釋放腫瘤細胞DNA進入外周血液，因此，檢測血清或血漿的循環DNA含量的變化，可反映腫瘤的存在和嚴重程度，同時循環DNA檢測具有微創性，標本獲取方便，價格低廉等優點，因此腫瘤循環DNA的研究可為腫瘤標志物開辟一片廣闊前景。本研究旨在通過對健康人群、肝炎、肝硬化及HCC病人血漿中循環DNA濃度的測定，探討血漿中循環DNA的檢測在原發性肝癌早期診斷中的意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象 40例肝細胞癌（HCC）均為住院病例，其中男性29例，女性11例，年齡38－65歲，中位年齡58歲。全部病例均經病理組織學診斷為原發性肝癌，其中AFP≥400μg／L的22例。30例肝硬化患者組，其中男性18例，女性12例，年齡36－79歲，中位年齡65歲。20例肝炎患者組，其中男性12例，女性8例，年齡35－75歲，中位年齡62歲。25例健康對照血漿來自健康體檢者，男性15例，女性10例，年齡35－72歲，中位年齡60歲。四組資料在年齡及性別上比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 標本采集 所有HCC病例均于入院后次日留取靜脈血標本，全部標本經低溫離心機4℃3 000 rpm離心15min后分離血漿，以每管800μl分裝置－20℃保存備用。相同方法采集保存50例肝臟良性疾病、25例健康體檢者血漿。

1.3 實驗方法

1.3.1 血漿DNA的抽提和純化 血漿DNA的抽提采用血液DNA快速提取試劑盒（深圳亞能公司），對其中的操作步驟適當改良（按比例擴大每次處理的血漿量，DNA得率和純度無影響），每300μl血漿獲得80μl的DNA，所有保存血漿標本均采用同一批號的試劑盒抽提DNA以減少批間誤差并統一集中檢測。

1.3.2 血漿DNA定量 采用ABI7500進行實時熒光定量PCR分析。β肌動蛋白（β－actin）擴增引物序列為：正向引物5’－AAGGTGACAGCAGTCGGTTGGA－3’，反向引物5’－GAGAAGTGGGGTTTTAGGA－3’，擴增產物為156bp。正常人白細胞基因組DNA用NanoDrop ND－1000定量，再用easy solution溶液（Takara）梯度稀釋（250、50、10、2）ng／ml后作為標準品構建標準曲線，對待測樣品進行定量。PCR擴增反應體系的總體積為20μl，包括7.2μl蒸餾水，10μl SYBR GreenⅠ，0.4μl的上游引物和0.4μl的下游引物，2μl模板。反應條件為：95℃1m，1個循環，95℃10s，60℃30s，35個循環，95℃1s，65℃持續收集。

1.4 統計學處理

全部資料用SPSS 17.0軟件分析，采用非參數檢驗比較不同組間血漿DNA水平的差異，統計學顯著性水平為P＜0.05，ROC曲線評估采用GraphPad Prism（V5.0，GraphPad Software）進行分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組病例的血漿循環DNA的濃度與健康對照組循環DNA濃度的比較 原發性肝癌組血漿循環DNA水平中位值為17.090ng／ml（7.870－48.010 ng／ml），明顯高于健康對照組9.014ng／ml（2.664－25.820ng／ml）（P＜0.05）；肝硬化組血漿循環DNA水平中位值為8.182ng／ml（2.464－40.360 ng／ml），和健康對照組的血漿循環DNA濃度比較無明顯差異（P＞0.05）；肝炎組血漿循環DNA平均濃度為7.447ng／ml（3.086－38.710ng／ml），和健康對照組的血漿循環DNA濃度比較無明顯差異（P＞0.05）。（見表1）

表1 HCC組、肝硬化組、肝炎組和健康對照組血漿DNA含量比較

2.2 ROC曲線分析用于評價血漿循環DNA濃度的檢測對于診斷肝癌的價值 如圖1所示，肝癌組與健康對照組的血漿循環DNA濃度進行比較，AUC值（0.8450）大于0.5，統計學表明血漿循環DNA水平可作為輔助診斷肝癌的指標（P＜0.05），以血漿循環DNA濃度11.92ng／ml作為診斷HCC的臨界值，其診斷特異度為84.0%，敏感度達72.5%。而肝硬化組與健康對照組比較的AUC值為0.6212，略高于0.5，統計學比較表明不足以將兩者區分開（P＝0.1920），肝炎組與健康對照組比較的AUC值為0.6667，統計學比較表明不足以將兩者區分開（P＝0.0833）。

2.3 聯合血漿循環DNA的檢測和AFP的檢測兩項指標對肝癌早期診斷的意義 2001年9月全國肝癌學術會議確定將AFP≥400μg／L作為HCC臨床診斷的陽性閾值［8］。在本研究中，HCC組中有22例AFP≥400μg／L，單獨用AFP指標對HCC的診斷率為55%，在18例AFP＜400μg／L的患者中，有9例患者血漿循環DNA濃度增高超過臨界值，因此，聯合兩項指標可將肝癌的診斷率提高至77.5%（31／40）。

圖1 ROC曲線分析

3 討論

循環DNA是存在于血清和血漿中的游離DNA，近年來日益增多的研究表明，腫瘤在生長過程中能持續釋放腫瘤細胞DNA進入外周血液，循環DNA能維持和表達腫瘤細胞來源的分子遺傳特性，因此通過檢測血漿循環DNA的總量可以反映腫瘤的存在和嚴重程度。2006年，逄錦忠［9］等報道，HCC患者血漿循環DNA與腫瘤組織微衛星變異有較高的一致性變化，血漿循環DNA可以用來反映腫瘤組織的微衛星變異。2008年，Catherine［10］等報道，血漿中結腸癌特異性甲基化DNA可用于結腸癌的篩查。2009年，Eric［11］等通過熔解曲線分析技術對外周血甲基化DNA進行定量，用以診斷腫瘤。2012年，蔣葉［12］等人動態監測急性髓系白血病（AML）患者血漿循環DNA的含量，結果發現AML患者組血漿DNA含量顯著高于對照組，血漿DNA定量檢測對AML的化療療效判斷和復發監測具有重要意義。因此，外周血循環DNA定量可能成為一種新的腫瘤診斷及預后判斷的標志物。本研究主要通過檢測肝癌患者外周血循環DNA的含量變化，探討外周血循環DNA水平作為肝癌早期診斷指標的可行性，實驗中通過定量檢測健康人、慢性活動性肝炎、肝硬化及肝癌患者血漿循環DNA濃度，結果顯示肝炎組、肝硬化組血漿循環DNA濃度與健康組比較無統計學差異，而肝癌組DNA含量較健康組高，具有統計學差異（P＜0.05）。ROC曲線分析表明，血漿循環DNA定量對肝癌具有較高診斷價值（AUC＝0.8450），當最佳臨界值（CUTOFF值）為11.92ng／ml時，敏感性為72.5%，特異性為84.0%，因此，外周血循環DNA水平對肝癌的診斷有一定價值。

目前臨床上原發性肝癌常用的輔助診斷和監測的血清學指標是AFP，然而AFP的靈敏度有限，AFP診斷原發性肝癌的陽性率為55%－65%［13，14］。本組實驗在AFP陽性（≥400μg／L）檢測的22例患者中，20例患者血漿循環DNA濃度大于CUTOFF值11.92μg／L，在AFP陰性（＜400μg／L）檢測的18例患者中有9例患者血漿循環DNA濃度大于CUTOFF值，可以看出血漿循環DNA濃度檢測比傳統的血清蛋白腫瘤標志物的檢測更靈敏，更有利于腫瘤的早期診斷。另外，在有些病例中，循環核酸的水平隨著成功的抗癌治療而下降，這提示循環中游離DNA可以被用來監測疾病的進展。由于所獲得病例數有限，對肝癌患者進行血漿循環DNA定量檢測可能用于抗癌療效監測還有待進一步研究。

以循環DNA為基礎的核酸分析，具有取材容易、微創傷性等特點，并適合動態檢測，避免了采集癌組織作為標本來源的困難，因此，在腫瘤篩查方面極具前景，但由于血漿循環DNA并不具有HCC的特性，因此聯合檢測血漿循環DNA含量和血漿循環DNA中HCC特異性基因改變如甲基化、SNP等可能是將來這一領域的主要研究方向，有望為肝癌的早期診斷、預后監測提供更加敏感、特異的指標。

［1］Hoshida Y，Moeini A，Alsinet C，et al.Gene signatures in the management of hepatocellular carcinoma［J］.Semin Oncol，2012，39（4）：473.

［2］Kanda M，Nomoto S，Okamura Y，et al.Promoter hypermethylation of fibulin 1gene is associated with tumor progression in hepatocellular carcinoma［J］.Mol Carcinog，2011，50（8）：571.

［3］李 鵬，翟 云，劉 暉，等.血清AFP、GPC3、VEGF、IGF－Ⅱ單獨及聯合檢測對原發性肝細胞癌的診斷價值［J］.世界華人消化雜志，2010，18（25）：2702.

［4］Lehner J，St?tzer OJ，Fersching D，et al.Circulating plasma DNA and DNA integrity in breast cancer patients undergoing neoadjuvant chemotherapy［J］.Clin Chim Acta，2013，425：206.

［5］Ken C，Hong Z，Li－Na Z，et al.Value of circulating cell free DNA in diagnosis of hepatocellular carcinoma［J］.World J Gastroenterol，2013，19（20）：3143.

［6］González－MasiáJA，García－Olmo D，García－Olmo DC.Circulating nucleic acids in plasma and serum（CNAPS）：applications in on－cology［J］.Onco Targets Ther，2013，6：819.

［7］楊英俊，黃 平，李程華，等.肝細胞癌患者血漿hTERT DNA的檢測及其臨床意義［J］.臨床檢驗雜志，2011，29（4）：260.

［8］楊秉輝，夏景林.原發性肝癌的臨床診斷與分期標準［J］.中華肝臟病雜志，2001，9（6）：324.

［9］逄錦忠，欽倫秀，任 寧，等.肝細胞癌患者血漿循環DNA微衛星變異的研究［J］.中華醫學雜志，2006，86（24）：1662.

［10］Catherine Lofton－Day，Fabian Model，Theo Pevos，et al.DNA methylation biomarkers for Blood－Based Colorectal cancer screening［J］.Clinical Chemistry，2008，54（2）：414.

［11］Eric Smith，Michael E Joes，Parla Drew.Quantitation of DNA methylation by melt curve analysis［J］.BMC Cancer，2009，123：1.

［12］蔣 葉，潘世揚，夏文穎，等.急性髓系白血病患者血漿循環DNA動態監測及其臨床意義［J］.中國實驗血液學雜志，2012，20（1）：53.

［13］侯 旭，王廣義，劉 凱，等.AFP及GP73的聯合檢測與肝細胞癌早期診斷和復發監測［J］.中華臨床醫師雜志，2011，5（11）：3229.

［14］Kokudo N，Makuuchi M.Evidence－based clinical practice guidelines for hepatocellular carcinoma in Japan：the J－HCC guidelines［J］.J Gastroenterol，2009，44：119.

Quantitative analysis of circulating DNA level in plasma from patients with hepatocellular carcinoma and its clinical signif－icance

RAN Gui－ping1，2，HUANG Hai1，YANG Guo－zhen1，et al.（1.Guiyang Medical College，Guiyang550004，China；2.Shanghai Fengcheng Hospital，Shanghai 201411，China）

Objective To quantify the circulating DNA level in plasma from patients with hepatocellular carcinoma（HCC），and to explore its significance for early diagnosis in HCC patients.Methods Blood samples were collected from 40HCC patients，30patients with liver cirrhosis，20patients with chronic active hepatitis and 25healthy controls.Circulating DNA in plasma was extracted and quantified by detecting theβ－actin gene through real－time quantitative PCR method.Results The median values of plasma circulating DNA concentration among the HCC group，cirrhosis group，hepatitis group and healthy control group were 17.090ng／ml，8.182ng／ml，7.447ng／ml and 9.014ng／ml respectively.There is significant difference between the HCC group and healthy control（P＜0.05）and no significant difference between the cirrhosis group and healthy control（P＞0.05），no significant difference between the hepatitis group and healthy control（P＞0.05）.Receiver operating characteristic（ROC）analysis demonstrated that the circulating DNA level could be used to distinguish HCC from healthy control（AUC＝0.8450）with sensitivity of 72.5%and specificity of 84.0%at the cut－off value of 11.92ng／ml.The combined analysis of using both plasma circulating DNA level and AFP revealed an elevated detection rate of 77.5%.Conclusion The detection of plasma circulating DNA level can be an effective supplement index for the diagnosis of HCC.

Hepatocellular carcinoma；Circulating DNA；real－time PCR

R735.7

A

冉貴萍，女，42歲，碩士，副主任技師，研究方向：腫瘤分子診斷。

2014－10－15）

1007－4287（2015）06－0918－04

國家級教學團隊（教高函［2009］18號）

＊通訊作者