黃芪及其提取物對矽肺模型大鼠支氣管肺泡灌洗液MMP-2、MMP-9表達的影響*

顏春魯，陳 麗，胡繼宏，岳 嘉，張書楠，慕婷婷，朱俊燚，雒志義

1甘肅中醫藥大學敦煌醫學與轉化教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；2天津中醫藥大學

黃芪及其提取物對矽肺模型大鼠支氣管肺泡灌洗液MMP-2、MMP-9表達的影響*

顏春魯1，2，陳 麗1△，胡繼宏1，岳 嘉1，張書楠1，慕婷婷1，朱俊燚1，雒志義1

1甘肅中醫藥大學敦煌醫學與轉化教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；2天津中醫藥大學

目的：觀察黃芪及其提取物對矽肺模型大鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchi al al veol us fl ui d，BA LF)M M P-2和M M P-9表達的影響，探討黃芪抑制矽肺纖維化的作用機制。方法:SPF級W i st ar雄性大鼠120只，隨機分為正常組、模型組、乙酰半胱氨酸組、黃芪水煎液組、黃芪總苷組、黃芪多糖組，每組20只。大鼠水合氯醛麻醉后，采用經氣管染Si O2粉塵法復制矽肺模型。干預組注入Si O2粉塵后1d開始用黃芪提取物及黃芪總苷灌胃，正常組及模型組給予等體積的生理鹽水灌胃。觀察各組肺組織病理改變，行支氣管肺泡灌洗術，用ELISA法檢測支氣管肺泡灌洗液M M P-2及M M P-9的表達。結果：各時段模型組M M P-2和M M P-9表達較正常組均降低(P＜0.05)，而乙酰半胱胺酸組、黃芪各干預組各時段表達均低于模型組，在28天M M P-2和M M P-9表達均下降(P＜0.05)。結論：黃芪能降低矽肺模型大鼠支氣管肺泡灌洗液M M P-2、M M P-9的表達，這可能是其抑制矽肺纖維化形成的機制之一。

黃芪；矽肺；M M P-2；M M P-9

肺纖維化效應細胞分泌的生物活性分子基質金屬蛋白酶(matrix metallo proteinase，MMP)在細胞外基質(extra cellular matrix，ECM)的合成和降解中具有重要意義。而在MMP家族中，MMP-2和MMP-9的特異性底物是IV型膠原，同時IV型膠原是肺泡壁基底膜的重要成分。肺間質纖維化過程中很重要的部分即肺泡上皮細胞和基底膜的損傷［1］。筆者用黃芪及其提取物治療SiO2所致矽肺纖維化，在肺纖維化形成過程中的不同階段提取支氣管肺泡灌洗液，應用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測MMP-2和MMP-9的表達，從而對黃芪治療矽肺的機理進行探討。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雄性Wistar大鼠120只，由甘肅中醫學院實驗動物中心提供(實驗動物合格證號：SCXZ(甘)2011-0001-0001302)，體質量180～220 g。隨機分為正常組、模型組、乙酰半胱氨酸組、黃芪水煎液組、黃芪總苷組和黃芪多糖組，每組20只大鼠。

1.2 實驗藥物 SiO2粉塵(Sigma公司，純度99%，粒子直徑在0.5～1.0 μm，80%粒子在1～5 μm)；黃芪水煎液(甘肅中醫學院實驗中心制作)；黃芪總苷(AST)(南京光潤生物制品有限公司生產，批號GR20120920AS2)；乙酰半胱氨酸泡騰片(富露施，注冊證號H20090620)；大鼠基質金屬蛋白酶2 (MMP-2)ELISA檢測試劑盒(上海源葉生物科技有限公司生產，批號：20130608B)；大鼠基質金屬蛋白酶9(MMP-9)ELISA檢測試劑盒(上海源葉生物科技有限公司生產，批號：20130608B)。

1.3 儀器 MOD-EL680型全自動酶標分析儀(美國伯樂公司提供)；BL121SS型電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司提供)；GL-20A全自動冷凍高速離心機(湖南儀器儀表總廠離心機廠提供)；721分光光度計(上海第一醫學院儀器廠提供)；BX41顯微鏡系統(日本奧林巴斯)等。

1.4 方法

1.4.1 造模 大鼠水合氯醛麻醉后，采用經氣管染SiO2粉塵法復制矽肺模型。各干預組注入SiO2粉塵后1天開始用藥物灌胃，正常組及模型組給予等體積的生理鹽水灌胃。

1.4.2 給藥 黃芪水煎液組給藥量：20 g/kg，黃芪總苷(AST)給藥量：20 mg/kg，黃芪多糖給藥量：40mg/kg，乙酰半胱氨酸泡騰片給藥量：200mg/kg。

1.4.3 檢測指標 第7、14、28天分批處死大鼠，觀察肺組織病理改變，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA法)檢測支氣管肺泡灌洗液 MMP-2和MMP-9活力。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0分析軟件對數據進行單因素方差分析。結果采用(±s)表示，用SNK-q檢驗進行組間兩兩比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物活動狀態 大鼠造模后飲水和飲食均恢復，但模型組有個別大鼠精神不振。隨后觀察發現，正常組大鼠飲水、飲食及精神均正常；而模型組與其他各個干預組均發現大鼠飲水及飲食明顯減少，精神狀態差，對刺激的反應較遲鈍，嗜睡，毛發蓬松，色晦暗。

2.2 肺臟外觀肉眼觀察 正常組大鼠肺臟呈粉紅色，表面光滑，彈性良好。模型組第7天可見大鼠雙肺呈鮮紅色，有散在出血點，體積增大，第14天兩肺處顯暗紅色陳舊出血，第28天可見雙肺蒼白、體積較小、彈性差、硬度增加、表面凸凹不平。各干預組和模型組病變基本一致，但程度較輕。

2.3 H E染色形態學檢測結果 黃芪水煎液組在28天可見炎癥改變，巨噬細胞浸潤，肺泡腔和肺間質可見含塵巨噬細胞灶，肺泡融合呈不同程度肺氣腫改變；矽肺模型組28天有肺間質炎癥細胞浸潤，主要為巨噬細胞和淋巴細胞，并有明顯矽結節出現，見圖1。

圖1 黃芪水煎液組與模型組第28天肺組織比較(H E染色，×400)

2.4 支氣管肺泡灌洗液M M P-2和M M P-9表達的檢測 不同時期模型組與正常組MMP-2表達的差異均有統計學意義(P＜0.05)，而乙酰半胱氨酸組MMP-2 (7、14、28天)表達較同期模型組下降(P＜0.05)，黃芪水煎液組、黃芪總苷組和黃芪多糖組在第28天MMP-2表達與模型組比較均下降(P＜0.05)，各干預組比較差異無統計學意義，見表1。不同時期模型組與正常組MMP-9表達的差異均有統計學意義(P＜0.05)。乙酰半胱氨酸組和黃芪水煎液組MMP-9在14天、28天表達較同期模型組下降(P＜0.05)，黃芪總苷組和黃芪多糖組在第28天MMP-9表達與模型組比較均下降(P＜0.05)，黃芪總苷組和黃芪多糖組在第28天MMP-9表達與模型組比較亦下降(P＜0.05)，各干預組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

表1 大鼠BA LF M M P-2的動態變化 ng/m L

表2 大鼠BA LF M M P-9的動態變化 ng/m L

3 討論

目前較公認的矽肺發病機制是肺部持續性的炎癥反應與纖維化反應交織進行的不可逆過程，早期以炎癥反應為主，晚期以肺纖維化為主［2］。我們通過氣管注射二氧化硅粉塵懸液，使大鼠肺組織發生改變，建立矽肺模型，實驗結果顯示，造模大鼠均有不同程度的活動減少、嗜睡、少吃等癥狀。通過觀察其病理變化，發現模型組大鼠在第28天有明顯矽結節形成，而黃芪水煎液組大鼠肺臟同期雖有炎性反應和纖維化的形成，但病變程度較輕，說明黃芪可減輕和緩解矽肺纖維化的進程。

基質金屬蛋白酶(MMPs)作為一組細胞外基質降解酶，它可以調節細胞基質的代謝，對肺間質纖維化的病理過程有非常重要的作用。本研究發現在矽肺發生的早期，即肺泡炎階段MMP-2、MMP-9的表達會明顯增加，而在矽肺形成的后期MMP-2、MMP-9雖然較早期有所下降，但仍然表達很高。這說明在肺損傷過程中細胞基質的代謝非常活躍。細胞基質代謝紊亂與矽肺纖維化形成有關。在肺纖維化形成的過程中，總的基質金屬蛋白酶在矽肺發生階段會參與細胞外基質與基底膜的降解，而在修復階段能夠調節肺組織的重塑［3］。

中藥黃芪生用有益氣固表、利水消腫、托毒生肌功效，蜜炙黃芪有補氣、養血、益中功效［4］，臨床常用于矽肺的治療。本實驗研究顯示，模型組與各干預組MMP-2和MMP-9在第7天時表達最高，然后均逐漸下降，但各干預組下降較快，到第28天時MMP-2和MMP-9水平均基本接近正常，其中乙酰半胱氨酸組下降最為明顯。MMP-2能通過分解Ⅳ型膠原蛋白及糖蛋白成分使肺基質成分降解，破壞肺泡壁結構的完整性，從而使成纖維細胞遷移到肺泡腔，造成肺泡腔內纖維化［5］。第28天MMP-2在黃芪各干預組的表達低于模型組，提示黃芪通過抑制MMP-2表達，從而延緩或抑制肺纖維化。肺纖維化大鼠在造模前14天以肺泡炎的病理改變為主，有研究認為MMP-9可能與早期上皮基底膜損傷有關，參與了細胞外基質和基底膜的降解［6］。黃芪水煎液組與乙酰半胱氨酸組的MMP-9明顯下降，且在第14天時MMP-9的表達均明顯低于模型組，推測黃芪與乙酰半胱氨酸可能是通過抑制MMP-9表達，從而延緩、減輕早期肺泡炎的發生。

綜上所述，本實驗結果提示，SiO2誘導的矽肺模型在不同時期MMPs的表達不同，以MMP-2和MMP-9增加為主，與有關報道一致，黃芪水煎液及其提取物可能通過抑制MMP-9在肺纖維化大鼠肺內的表達，減輕早期的肺泡炎，抑制MMP-2的表達，延緩和抑制后期肺纖維化的發生。

［1］ Tom ohi t o G，H i rom i chi G，M i t suo T，et al. Rel at i onshi p bet w een abdom i nalfat accum ul at i on and i nsul i n resi st ance i n hem odi al ysi s pat i ent［J］.H ypert en Res，2008，32(1)：83-88.

［2］ 王飛，陳平，曹國平，等.補陽還五湯對肺纖維化大鼠肺泡巨噬細胞腫瘤壞死因子的影響［J］.中藥藥理與臨床，2005，21(3)：5-7.

［3］ 馬小兵，曹金玲，朱蘭.Si O2對人肺泡巨噬細胞及肺成纖維細胞基質金屬蛋白酶及其組織抑制因子表達的影響［J］.現代預防醫學，2009，36(18):3526-3528.

［4］ 聶紫雯，魏強華.黃芪免疫調節機制及臨床應用進展［J］.中國中醫藥信息雜志，2009，16(8):103-105.

［5］ O rt i z LA.A nt i fi brot i c t herapy for t he t reat m entof pul m onary fi brosi s［J］. A m J M ed Sci，2001，322(4):213-221.

［6］ W ong S，Bel vi si M G，Bi rrel l M A.M M P/TIM P expressi on profi l es i n di st i nct l ung di sease m odel s；Im pl i cat i ons for possibl e fut ure t herapi es［J］.A MJ Respi r Res，2009，10(1):72-78.

Influence of HuangQi and Its Extractive on the Expressions of MMP-2 and MMP-9 in Bronchial Alveolus Lavage Fluid of Rat Model with Silicosis

YAN Chunlu1,2,CHEN Li1△,HU Jihong1,YUE Jia1,ZHANG Shunan1,MU Tingting1,ZHU Junyi1,LUO Zhiyi1
1 Key Laboratory of Education Ministry Dunhuang Medicine and Translation from Gansu University of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China;2 Tianjin University of Traditional Chinese Medicine

Objective:To explore the mechanism of HuangQi(radix astragali)inhibiting silicosis by observing the influence of HuangQi and its extractive on the expressions of MMP-2 and MMP-9 in bronchial alveolus fluid (BALF)of rat model with silicosis.Methods:Altogether 120 SPF rats were randomized into the normal group,the model group,acetylcysteine group,HuangQi decoction group,total glycosides(TG)group of HuangQi and astragalus polysaccharides(APS)group,20 rats each group.Rat model with silicosis were duplicated by SiO2dust dyeing method through air tube after the rats accepted anaesthesia with chloral hydrate.The intervention group accepted intragastric administration of HuangQi extractive and HuangQi TG in one day after injecting SiO2dust,the normal group and the model group accepted intragastric administration of physiological saline in the same volumes.Pathological changes of pulmonary tissue were observed in different groups and bronchoalveolar lavage was performed, the expressions of MMP-2 and MMP-9 in BALF were detected by ELISA method.Results:The expressions of MMP-2 and MMP-9 of the model group were lower compared with the normal group in different times(P＜0.05), while the expressions were lower in acetylcysteine group and HuangQi intervention groups in different times,the expressions of MMP-2 and MMP-9 were decreased at 28 days(P＜0.05).Conclusion:HuangQi could decrease the expressions of MMP-2 and MMP-9 in BALF of rat model with silicosis,and it might be one of the mechanisms of inhibiting silicosis.

HuangQi;silicosis;MMP-2;MMP-9

R285.5

A

1004-6852(2015)10-0022-03

2014-12-27

敦煌醫學與轉化省部共建教育部重點實驗室開放基金(編號D H Y X 1213-002)；甘肅省教育廳第二批科研項目計劃(編號1106B-05)；甘肅中醫學院中青年基金項目(編號BH 2011-0020)。

顏春魯(1979—)，男，碩士學位，講師。研究方向：骨傷疾病的中醫藥防治。

△通訊作者：陳麗(1981—)，女，碩士學位，講師。研究方向：心血管與呼吸系統疾病的中醫藥防治。