NaCl對鹽節木種子萌發和幼苗生長的影響及促進根尖生長的細胞學研究

房娟娟，武玉玲，劉云，宮慧芳，馬榮崗，胡靈芝，陳惠

(山西師范大學生命科學學院，山西 臨汾 041004)

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NaCl對鹽節木種子萌發和幼苗生長的影響及促進根尖生長的細胞學研究

房娟娟**，武玉玲**，劉云**，宮慧芳，馬榮崗，胡靈芝，陳惠*

(山西師范大學生命科學學院，山西 臨汾 041004)

為了篩選基于MS培養基的鹽節木種子萌發與幼苗生長的最佳NaCl濃度，及初步探討NaCl滲透脅迫作用(使用MS鹽消除了NaCl的離子毒害作用)促進根生長的機制, 以MS為基本培養基研究了不同濃度的NaCl(0～700 mmol/L)對貯存7年的鹽節木種子在三角瓶中萌發及幼苗生長的影響，并用光學顯微鏡對適宜鹽濃度促進鹽節木根伸長的初步機制進行了根尖形態與細胞學觀察。結果表明, 1)儲藏7年的種子仍有活力，對照組的活力指數和萌發率分別為3.36和74.46%，但萌發時間與前人比較有所延遲。2)鹽節木種子的萌發具有不同步性，初始萌發天數為6～8 d，萌發可持續到25～30 d。3)基于 MS培養基鹽節木種子萌發最佳濃度為100～200 mmol/L，與對照比可使萌發時間提早2 d，且鹽害率為負值。4)幼苗生長適宜的NaCl濃度范圍為100～300 mmol/L，最佳濃度為200 mmol/L；鹽對幼苗表型的影響是MS0和NaCl>300 mmol/L的MS培養基中生長的幼苗在1個月內能促進多數幼苗下胚軸變紅，3～4個月后多數幼苗同化枝變紅，而附加100～200 mmol/L NaCl的培養基植株大多數呈綠色。5)根尖細胞學觀察可知：MS附加100和200 mmol/L NaCl促進根生長的原因是：NaCl促進了根尖分生組織細胞的分裂和伸長區與成熟區細胞的伸長，因而加速了根冠細胞的程序性細胞死亡，表現為根冠細胞脫落加快。本研究為鹽節木耐鹽機理的繼續深入研究打下了一定的基礎。

鹽節木；NaCl濃度；種子萌發；幼苗生長；細胞學觀察；組織培養法

鹽節木(Halocnemumstrobilaceum)屬于藜科(Chenopodiaceae)鹽節木屬(Halocnemum) 的一種多年生矮小肉汁半灌木,分布于非洲北部到歐洲的地中海，直到亞洲西部地區的鹽堿地上[1]，在我國主要分布于新疆和甘肅北部地區,是鹽生荒漠群落建群種之一[1-2]，屬于多汁鹽柴類半灌木荒漠群落類型[3]，在有些地區能夠形成單優群落[4]。鹽節木具有很強的耐鹽能力，甚至能夠在土壤表面具有5～10 cm厚鹽殼的生境中存活[5]，鹽節木是秋季牲畜的優良飼料，具有一定的經濟價值。目前，關于鹽節木的研究人們已關注了種子的萌發[1,6]、鹽對幼苗根長的影響[1,7]、群落特征[8-9]以及體內植物次生代謝產物類物質如黃酮、 咖啡酸酯及香豆素等的提取和資源開發[10-11]等方面的研究。最近，也開始涉及耐鹽基因的克隆和表達方面的研究[12]。

關于鹽節木種子萌發的研究，已有Qu等[1]及高瑞如等[6-7]的文獻報道，他們驗證了鹽分是限制鹽節木種子萌發的因素之一，光照能提高鹽節木的萌發率,最適萌發溫度為25～30℃等。鹽節木種子為小粒種子，前人對鹽生植物小粒種子一般采用在沙基中或培養皿水浸濾紙表面萌發[1,6-7,12-13]的方法，該方法受溫度濕度不穩、需稱重法補水、水淹、細菌滋生和沙埋機械阻力[14]等因素的影響；而且，單鹽NaCl溶液由于Na+毒害作用使得適宜種子萌發和幼苗生長的濃度低于土鹽復合鹽的濃度[6]。曾幼齡等[15]研究表明，鹽堿地區鹽脅迫下植物的萌發生長受抑制與滲透脅迫和離子毒害兩種效應有關，并且鹽生植物中起主要抑制作用的是滲透脅迫而不是離子毒害，本文利用組織培養法，基于MS培養研究不同濃度NaCl對儲存7年之久的鹽節木種子萌發和幼苗生長的影響，主要反映的是NaCl的滲透脅迫作用，旨在篩選基于MS培養基的最佳NaCl濃度，研究長期貯存鹽節木種子的活力，為進一步研究NaCl對鹽節木滲透脅迫的耐鹽機理建立有效的研究方法。該法是在無菌、恒溫、恒濕及營養充分的條件下進行的，不需要補水,可以克服前人方法的缺點,經過連續轉移繼代培養還可以清晰地觀察到不同鹽濃度對幼苗不同時期的生長發育表型的變化。前人只做過不同鹽濃度對鹽節木幼苗根長生長的影響[1], 但對促進根生長的根尖形態學和細胞學方面尚未研究。本研究擬進行以下3個方面的研究：1)基于MS培養基，pH=5.8條件下，鹽節木種子萌發、幼苗生長的最佳NaCl濃度的確定；2)儲存7年的鹽節木種子活力探究；3)適宜NaCl濃度促進鹽節木幼苗根生長的細胞學探究。

1 材料與方法

1.1實驗材料

鹽節木種子由本單位高瑞如老師于2003年采自新疆古爾班通古特沙漠南緣五家渠市蔡家湖鹽節木自然分布的群落中，種子貯于牛皮紙袋中，在室溫 (20～27℃)下通風處保存3年后轉到4℃保存4年。于2010年10月-2011年2月進行種子萌發、幼苗生長實驗。2013年補充了幼苗根尖細胞學觀察實驗。種子千粒重為(0.093±0.004) g，長(0.673±0.069) mm，寬(0.439±0.038) mm。

1.2實驗方法

1.2.1培養基的配制 MS為基本培養基，實驗共設置7個NaCl濃度梯度(100,200,300,400,500,600,700 mmol/L)和1個對照組(0 mmol/L)，每組設置6個重復，調pH為5.8，瓊脂8 g/L，蔗糖10 g/L，將培養基分裝于100 mL錐形瓶中，每瓶40 mL，共48瓶。

1.2.2種子的消毒及接種 取適量種子于eppendorf (EP)管中，在超凈工作臺內用70%乙醇處理1 min后用0.1%(w/v)升汞消毒8 min，無菌水沖洗3～4次，吸去多余水分。用解剖針挑取消毒后的成熟種子，每次1粒，接種在培養基上，每瓶30粒。培養溫度25℃左右，光周期為12 h光照/12 h 黑暗，相對濕度為50%左右，光照強度約3000 lx, 每月更換1次新鮮培養基。

1.2.3鹽節木種子萌發指標的計算方法 種子接種后，1～2 d觀察1次，以胚根露出種皮且胚根長度大于等于種子長度作為萌發的標準，分別在接種后的10,15,20,25,30 d統計萌發率。 種子發芽率(%)=萌發種子粒數/接種種子粒數×100；種子發芽勢(%)=發芽初期比較集中的天數的發芽率(30 d)；發芽指數(GI)=∑Gt/Dt，式中,GI為在t日的發芽數(30 d)，Dt為發芽天數[16]；活力指數=(胚芽長+胚根長)×發芽指數；相對鹽害率=[(對照發芽率-鹽處理發芽率)/對照發芽率]×100%[17]；相對發芽率=(鹽處理發芽率/對照發芽率)×100%[18]。

1.2.4幼苗生長發育表型的觀察 分別培養1,2,3,4個月后，從各個鹽濃度組選取30株代表性幼苗測量其株高和根長，并對4個月植株進行拍照。

1.2.5幼苗根尖的細胞學及形態觀察 鹽節木種子同步化萌發5 d后，選取形態大小相同的幼苗轉接到含瓊脂10 g/L直徑90 cm的培養皿中，實驗共設置4個NaCl濃度梯度(100, 200, 300, 400 mmol/L)和1個對照組(0 mmol/L)，每組設置3個重復，每皿30株幼苗分3行排列，進行平板垂直培養，培養10和30 d后，各選取10株代表性幼苗，截取約0.8 cm長的根尖，將根尖浸入2/3 HCG透明液(HCG透明液：80 g水合氯乙醛，10 mL甘油，溶于30 mL蒸餾水中)中透明5 min，然后在OLYPUS-X51 型顯微鏡下，對生長30 d的幼苗根尖包括根冠區和生長10 d的幼苗根尖通過仔細對焦對伸長區、成熟區細胞進行了細胞學觀察，并攝片。

1.3數據處理

采用Excel 軟件進行數據計算和作圖,采用SPSS 13.0軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1基于MS培養基不同NaCl濃度對種子萌發的影響

從表1可知，MS培養基中附加NaCl濃度小于等于400 mmol/L時，可促進鹽節木種子提早萌發，過高鹽濃度會抑制并延遲種子的萌發。半數種子萌發所需時間與初始萌發時間略有不同，高于300 mmol/L鹽濃度后就表現為萌發延遲。所以附加100～300 mmol/L NaCl的實驗組與對照組相比，能促進鹽節木種子提早1～2 d萌發。

圖1表明,種子萌發天數低于10 d時，MS附加100～400 mmol/L NaCl培養基上的種子萌發率均高于對照組，500 mmol/L NaCl與對照相當，600和700 mmol/L NaCl對種子萌發有強烈抑制。 萌發天數超過15 d后，僅100和200 mmol/L兩個濃度對鹽節木種子的萌發有促進作用，其他濃度都表現為抑制作用，并且隨著鹽濃度的增高，抑制作用增強。經多重比較分析發現，100 mmol/L NaCl處理組與對照組相比均具有顯著性差異，故100 mmol/L NaCl為鹽節木種子萌發的最適鹽濃度。

表1 不同NaCl濃度下種子初始萌發時間與半數種子萌發所需時間Table 1 The initiate time for seeds germination and the requiring time for half seeds germination under different concentration of NaCl

圖1 MS附加不同NaCl濃度培養基上鹽節木種子的萌發率

2.2基于MS培養基不同濃度NaCl對種子活力的影響

由表2可知，不同濃度的NaCl脅迫處理1個月后對鹽節木種子的萌發有明顯的影響，種子發芽勢和發芽指數隨NaCl濃度的升高表現為先升高后下降的趨勢，在100 mmol/L NaCl濃度時達到最大。從相對發芽率和相對鹽害率可以看出低濃度鹽(100～200 mmol/L NaCl)處理對其萌發有促進作用，而高濃度鹽(300～700 mmol/L NaCl)處理強烈抑制了種子的萌發。從活力指數方面分析，300 mmol/L NaCl處理下表現為最大，生物量最高。總體說明鹽節木可以耐受一定濃度范圍的NaCl而生存，低鹽環境尤其100～200 mmol/L NaCl顯著提高了種子的萌發指數、發芽勢，對種子萌發是有益的，高鹽環境不利于其萌發。

表2 不同NaCl濃度下種子發芽指數、活力指數、發芽勢、相對鹽害率及相對發芽率Table 2 Seed relative germination rate, germination vigor, germination index, vigor index and relative salt injury rate of H.strobilaceum under different concentration of NaCl

注:以上是培養1個月后的統計結果，每處理統計30株植株，SPSS 13.0軟件計算標準差、多重比較分析顯著性差異，同列不同字母表示差異顯著 (P<0.05).

Note:Above statistics results were made from seed cultured for one month, mean±SE for thirty replications, Duncan’s multiple range test by SPSS 13.0 software, different letters within the same column indicate significant differences (P<0.05).

2.3基于MS培養基不同NaCl濃度對幼苗生長的影響

由圖2A,圖3可知，在含MS附加100～500 mmol/L NaCl培養基上培養的鹽節木幼苗地上部分即株高均高于對照組MS0培養基上培養的植株，含600～700 mmol/L NaCl培養基上生長的植株，株高低于MS0上培養的植株。同一時期相比，MS附加200 mmol/L NaCl培養基上的植株明顯高于其他組，如在4個月時在此培養基上的植株株高是對照組植株的1.88倍，可以看出鹽節木的生長能耐受一定濃度范圍的鹽脅迫，在此濃度范圍內，對鹽節木的生長起促進作用，且最佳NaCl濃度是200 mmol/L。在此濃度上生長的植株除了株高高于其他處理組外，植株表型為生長比較健壯，同化枝呈現綠色，其他處理組除了植株矮化外，綠苗減少，同化枝大多數呈紅色，可能是由于鹽脅迫使得植物體內產生較多花青素的原因。當鹽濃度為700 mmol/L NaCl時，植株死亡。

圖3 MS附加不同NaCl濃度培養基上生長4個月的鹽節木幼苗

由圖2B可以看出，幾乎每個生長時期，NaCl濃度在100～300 mmol/L培養基上的實驗組植株的根長均比對照組要長，說明在此濃度范圍內，NaCl對根生長起促進作用，大于400 mmol/L時，根長變短，起抑制作用。在附加200 mmol/L NaCl的培養基上生長的幼苗根長最長，且顯著高于對照組和其他實驗組，可見幼苗根生長的最適鹽濃度也為200 mmol/L。

2.4NaCl對鹽節木幼苗根尖生長的形態學與細胞學研究

如圖4所示,對照組幼苗根尖呈錐形，直徑小，顏色深，透明液脫色困難，根冠部分相對不活躍，由于根尖分生組織相對處于靜止狀態，根冠脫落細胞數目少；而鹽濃度100～200 mmol/L培養基上生長的植株，其根尖直徑變大，顏色變淺，根尖生長點部分有較多的分泌物；鹽濃度為300～400 mmol/L時，根冠部分相對增厚，根冠細胞脫落變慢。這種現象間接說明在一定鹽濃度(100～200 mmol/L)能夠促進根冠包裹的根尖分生組織分裂加快，加速細胞程序性死亡，造成脫落物質增多，根冠變薄，對鹽節木根的生長起到了促進作用。

如圖5所示,與對照相比，在100～200 mmol/L NaCl培養基上生長的幼苗根尖，伸長區和成熟區的細胞變窄變長，單位面積內細胞數目逐漸增多。而分生區因太短不好區分，沒有攝片。由此可知，適宜鹽濃度能夠加快根尖分生區細胞的分裂速度，致使伸長區和成熟區細胞數目增多，根尖變粗。

圖4 含不同NaCl濃度MS培養基生長1個月的鹽節木幼苗根尖

圖5 含不同NaCl濃度的MS培養基上生長10 d的鹽節木幼苗根尖細胞學觀察

3 討論

前人用培養皿濕濾紙表面萌發法和沙培法[1,6-7,13]研究其種子萌發率，但因水淹、細菌滋生、沙埋機械阻力、種子(褐色)與沙培基質難于區分等原因，使研究和統計存在一定的困難，對結果的可靠性有一定影響。本研究采用組織培養法，培養基與鹽節木種皮的顏色區別明顯，便于觀察。而且，培養是在無菌、恒溫、恒濕等優越條件下進行，不受其他不利因素影響，對最適鹽濃度的篩選和種子萌發率的統計結果可靠性提高，為進一步研究其耐鹽機理打下了一定的基礎，也為其他小粒鹽生植物種子萌發和幼苗生長最佳耐鹽濃度的篩選提供了可以借鑒的方法。

本研究表明,100～200 mmol/L NaCl是鹽節木種子萌發較適宜的鹽濃度范圍，幼苗生長的最適宜濃度為200 mmol/L。該結論與高瑞如等[6]采用培養皿濕濾紙表面萌發法所得研究結果有所不同，高瑞如等[6]的結果顯示,當單鹽NaCl溶液電導率為3.125 dS/m(相當于0.32%；57 mmol/L NaCl)時，鹽節木種子萌發率達到最高，幼苗根長達到最大，比本研究的最適濃度100～200 mmol/L要低很多。而土鹽(復合鹽)溶液15.630 dS/m(相當于1.0%；285 mmol/L NaCl)與本實驗結果100～300 mmol/L NaCl種子萌發率相差不大，進一步證明了MS培養基中其他鹽離子與NaCl存在拮抗作用，進而提高了幼苗的耐鹽性，也說明MS培養基在一定程度內能夠模擬土鹽，從而較為準確地反映出植物適鹽的真正規律。曾幼齡等[15]的研究表明，鹽堿地區鹽生植物受到滲透脅迫和離子毒害兩種脅迫的影響，并且主要是滲透脅迫而不是離子毒害，基于MS培養基研究，消除了離子毒害作用，主要反映的是NaCl的滲透脅迫作用，從而為進一步研究NaCl對鹽節木的滲透脅迫機制打下了基礎。

觀察鹽節木幼苗表型可知：生長在無NaCl的MS0培養基和含鹽高于300 mmol/L的MS培養基上的植株，1個月內下胚軸表現為紅色，3～4個月后同化枝呈紅色，而生長在適宜鹽濃度培養基上的植株大多數為綠色，說明無鹽和高鹽對鹽節木幼苗都有脅迫作用，引起體內花青素的生物合成，以提高抗逆性[19]。

與前人的研究結果相似，鹽節木種子的萌發具有不同步性。Qu等[1]采用新收種子進行研究，直到第15天仍然有開始萌發的種子，而本研究用貯存7年的種子，在無鹽的MS培養基上萌發率可高達74%，只是萌發時間延遲，萌發可持續到第25～30天，說明陳舊種子仍有萌發力，可能由于種子劣變導致了萌發時間的延遲。另外，其他鹽生植物的種子也存在萌發的不同步性[13，20-21]。那么，鹽生小粒種子同步化萌發有待進一步研究。

另外，本研究用透明液處理鹽節木根尖后進行了形態學和細胞觀察，發現不同鹽濃度處理下根尖形態尤其根冠形態和根尖伸長區、成熟區細胞長度和數目有差異，反映到宏觀方面就是幼苗根長的不同，有關鹽節木這方面的研究還未見報道，本研究也為其他鹽生植物耐鹽機理的研究提供了可以借鑒的方法。

4 結論

本研究采用組織培養法，以MS為基本培養基，研究了不同NaCl濃度對鹽節木種子萌發和幼苗生長的影響，此外，還對適宜NaCl濃度促進根尖生長的形態學和細胞學進行了觀察，結論如下：1)儲藏7年的種子仍有活力，對照組的活力指數和萌發率分別為3.36和74.46%，但萌發時間與前人[1]比較有所延遲，且萌發具有不同步性，萌發時間可從6 d持續到25～30 d。2)基于MS培養基，鹽節木種子萌發的最佳NaCl濃度范圍為100～200 mmol/ L，不僅能提早萌發1～2 d，萌發率提高到84.00%，且鹽害率為負值。3)基于MS培養基，鹽節木幼苗生長的最佳NaCl濃度為200 mmol/L。地上部分耐鹽濃度高，100～400 mmol/L甚至500 mmol/L NaCl都有促進作用;根的耐鹽濃度較低100～300 mmol/L NaCl有促進作用。4)低濃度的鹽(100～200 mmol/L)促進根生長的原因是NaCl能促使根尖生長點代謝旺盛，分裂加快, 也促進了根伸長區和成熟區細胞數目的增多，長度增加, 從而促進了根冠細胞的程序性死亡即脫落加快,最終促進了根的伸長。

總之，本研究基于MS培養基，消除了NaCl的離子毒害作用，主要體現了其滲透脅迫作用，篩選出了鹽節木種子萌發和幼苗生長的最佳NaCl濃度，分別為100和200 mmol/L，也初步通過對根尖的形態學和細胞學觀察，了解到NaCl促進鹽節木根生長的機制是加快了根尖分生區細胞的分裂和伸長區、成熟區細胞的伸長,從而加速了根冠的程序性細胞死亡。本研究為鹽節木耐鹽機理的深入研究奠定了一定基礎，并提出了新的研究課題——鹽節木種子同步化萌發研究。

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Effects of NaCl on seed germination and seedling growth ofHalocnemumstrobilaceumFANG Juan-Juan**, WU Yu-Ling**, LIU Yun**, GONG Hui-Fang, MA Rong-Gang, Hu Ling-Zhi,

CHEN Hui*

CollegeofLifeScience,ShanxiNormalUniversity,Linfen041004,China

In order to identify the optimal NaCl concentration in MS (Murashige and Skoog) medium for seed germination and growth ofHalocnemumstrobilaceum, and to reveal the primary mechanism of salt osmotic stress (using MS salt medium) promotion of root growth in this species.We used MS medium as a basic medium and added different concentrations of NaCl (0-700 mmol/L) and measured the response of seed germination and seedling growth by culturing seeds stored for 7 years.In addition seedling root tips were cultivated on media with optimum salt concentration to allow morphological and cytological observations under a light microscope.After 7 years of storage seed retained vigor; the seed vigor index and seed germination rate of the control treatment was 3.36 and 74.46% respectively, but germination time appeared to be delayed.Seed germination was not synchronized, beginning after 6-8 days and continued for 25-30 days.The optimum concentration of NaCl in MS medium for seed germination ranged from 100 to 200 mmol/L and compared with the control group, seeds germinated 2 days earlier.However, at NaCl concentrations over 400 mmol/L seed germination was strongly inhibited.The most appropriate salt concentration range in MS medium for seedling growth was 100-300 mmol/L and the optimum concentration was 200 mmol/L.Observation of plant phenotype revealed that seedlings cultured on media with no or medium salt (>300 mmol/L) produced red hypocotyls and subsequently red pigmentation in most plant tissue (3-4 months growth).Root tips from seedlings cultured in medium salt conditions had accelerated root tip cell division and elongation and subsequently promoted root cap cell death and abscission.This investigation provided a good foundation for further study on the salt resistance mechanism ofH.strobilaceum.

Halocnemumstrobilaceum; NaCl concentration; seed germination; seedling growth; cytological observation; tissue culture

10.11686/cyxb2015058

http://cyxb.lzu.edu.cn

2015-01-27；改回日期：2015-03-18

山西師范大學高等學校大學生創新性實驗項目(SD2011CXSY-9，SD2012CXSY-38)資助。

房娟娟(1988-),女，山西襄汾人,碩士。E-mail:839652226@qq.com。武玉玲(1989-),女，山西洪洞人,本科。E-mail:32852624@qq.com。劉云(1990-)，女,山西平遙人,在讀碩士。

房娟娟, 武玉玲, 劉云, 宮慧芳, 馬榮崗, 胡靈芝, 陳惠.NaCl對鹽節木種子萌發和幼苗生長的影響及促進根尖生長的細胞學研究.草業學報, 2015, 24(12):196-203.

FANG Juan-Juan, WU Yu-Ling, LIU Yun, GONG Hui-Fang, MA Rong-Gang, HU Ling-Zhi, CHEN Hui.Effects of NaCl on seed germination and seedling growth ofHalocnemumstrobilaceum.Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(12):196-203.

**共同第一作者These authors contributed equally to this work.

*通信作者Corresponding author.E-mail:xhchen_0809@163.com