BNIP3在心肌梗死GK糖尿病大鼠中的表達及氯化鈷對心肌細胞的影響

王聿杰 齊國先 鄭曉偉

BNIP3在心肌梗死GK糖尿病大鼠中的表達及氯化鈷對心肌細胞的影響

王聿杰 齊國先 鄭曉偉

目的 通過制作糖尿病大鼠和非糖尿病大鼠心肌梗死模型,研究BNIP3在糖尿病大鼠心肌梗死中的表達,探討慢性氯化鈷處理對糖尿病大鼠血糖及心肌細胞凋亡的影響。 方法 應用體質量200～250g的雄性GK(Goto-kakizaki)糖尿病大鼠及其對照雄性Wistar大鼠,通過開胸手術結扎麻醉大鼠冠狀動脈左前降支制作大鼠在體心肌梗死模型,心肌梗死模型制作前測量血糖,手術成功后分組喂養大鼠3周。3周后,測量血糖,剪取心臟,檢測缺血壞死區BNIP3的表達。 結果 與GK假手術組及心肌梗死組相比,GK心肌梗死+氯化鈷處理組血糖降低;與GK心肌梗死組相比,GK心肌梗死+氯化鈷處理組BNIP3基因表達減少;與Wistar假手術組及Wistar心肌梗死組相比,Wistar心肌梗死+氯化鈷組血糖未見明顯變化，與Wistar心肌梗死組相比，Wistar心肌梗死+氯化鈷處理組BNIP3蛋白及基因表達亦無明顯變化。 結論 慢性氯化鈷處理降低糖尿病大鼠血糖,減少BNIP3凋亡基因在缺血壞死區的表達,表明高血糖可能促進心肌細胞凋亡,降低血糖可以減少心肌細胞凋亡。

BNIP3; 糖尿病大鼠; 心肌梗死; 心肌細胞凋亡

2型糖尿病是冠心病最常見的合并癥之一。研究表明,冠心病合并糖尿病或者心肌梗死后發生應激性高血糖癥患者病情嚴重程度增加,且愈后不佳[1]，其機制成為臨床研究的熱點。多項研究都證明高葡萄糖會誘發心肌細胞發生凋亡。本試驗通過制作糖尿病大鼠和非糖尿病大鼠心肌梗死模型,研究BNIP3在糖尿病大鼠心肌梗死中的表達,探討慢性氯化鈷處理對糖尿病大鼠血糖及心肌細胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及主要試劑 Wistar大鼠購自中國醫科大學盛京醫院實驗動物部,Goto-kakizaki(GK)糖尿病大鼠購自上海斯萊特實驗動物有限責任公司,抗BNIP3抗體(武漢博士德公司),Trizol 試劑(Ivitrogen公司),氯化鈷(Sigma公司)。

1.2 心肌梗死模型的制備 應用體質量在200～250 g的雄性GK糖尿病大鼠及其對照雄性Wistar大鼠進行實驗。心肌梗死模型制作前測量血糖。通過開胸手術結扎麻醉大鼠冠狀動脈左前降支制作大鼠在體心肌梗死模型。手術成功后分組飼養大鼠3周。

1.3 實驗分組及處理 實驗分組:Wistar假手術組,Wistar心肌梗死組, Wistar心肌梗死+氯化鈷處理組,GK假手術組, GK心肌梗死組, GK心肌梗死+氯化鈷處理組,每組動物至少存活6只。Wistar和GK假手術組經歷手術過程,但只掛線不結扎冠狀動脈左前降支,心肌梗死組結扎冠狀動脈左前降支,心肌梗死+氯化鈷處理組,于術前2 d開始飲用1.5 mmol/L氯化鈷的水,術后給予飲用含2 mmol/L氯化鈷的水,每組動物均不限制飲食。分組喂養3周時,測量血糖,活體剪取心臟,生理鹽水沖洗后,每組中2個心臟凍存于-70 ℃冰箱中,留待生化檢測,另4個心臟存于4%多聚甲醛溶液中固定,沿左室長軸由心底至心尖做厚切片(結扎左前降支的心肌梗死組,由結扎處至心尖做厚切片),石蠟包埋切片。

1.4 血糖的測定 術前及術后3周血糖的測定均采用同一方法:10%的水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠后,用眼科剪斷尾采血,應用美國強生血糖儀(SureStep Plus,LifeScan)及配用的血糖試紙測量血糖。

1.5 Western blot檢測 提取心肌總蛋白并調至同一濃度水平后聚丙烯酰胺凝膠電泳(每孔加樣20 μl)、轉膜、封閉,分別加入BNIP3 (19 kD)和β-actin (42 kD)一抗(兔抗鼠多克隆抗體,均1∶200稀釋),4 ℃孵育過夜、洗膜,加入二抗(兔IgG 1∶400)孵育1 h,自動凝膠成像分析系統測定條帶平均積分光密度(IOD),將各個蛋白IOD分別與內參β-actin IOD比值作為相應蛋白半定量指標。

1.6 RT-PCR檢測 采用 Trizol試劑一步法提取心肌細胞總RNA,紫外分光光度計測定純度并定量。根據GenBank提供的BNIP3和內參照β-actin 的mRNA序列,應用軟件Primer Premier 5.0自行設計引物,序列見表1。應用凝膠圖像分析系統進行灰度分析,BNIP3基因的表達值以BNIP3吸光度值/β-actin吸光度值×100%表示。每個樣品的RT-PCR反應至少重復3次。

表1 應用于RT-PCR引物

PCR反應條件:94 ℃、5 min,1個循環;94 ℃、30 s,56 ℃、30 s,72 ℃、1 min,35個循環; 72 ℃、5 min后結束擴增反應。取5 μl PCR產物與2 μl Lodding Buffer 混合,進行2%瓊脂糖凝膠電泳,100 V 1.5 h,電泳結束后凝膠成像儀分析。

2 結果

2.1 血糖比較 術前Wistar大鼠各組之間血糖無差異,GK糖尿病大鼠各組之間血糖亦無差異,但Wistar大鼠和GK糖尿病大鼠之間比較血糖差異明顯(P<0.01)。在Wistar大鼠中,術前與術后3周相比,血糖值無差異。在GK糖尿病大鼠中,假手術組與心肌梗死組血糖術前與術后3周無變化,而在GK心肌梗死+氯化鈷處理組,術前與術后3周血糖變化明顯(P<0.01)。見表2。

表2 術前及術后3周各組血糖的比較

注:與相同處理方法Wistar組比較,**P<0.01;與術前比較,△△P<0.01

2.2 BNIP3蛋白表達 在Wistar大鼠中,與Wistar假手術組相比,Wistar心肌梗死組及Wistar心肌梗死+氯化鈷處理組BNIP蛋白表達明顯增加(P<0.01)。但Wistar心肌梗死組與Wistar心肌梗死+氯化鈷處理組相比BNIP蛋白表達無差異(P=0.812)。而在GK糖尿病大鼠中,與GK假手術組相比,GK心肌梗死組及GK心肌梗死+氯化鈷處理組BNIP3蛋白表達增加(P<0.01),并且與GK心肌梗死組比較,GK心肌梗死+氯化鈷處理組BNIP3蛋白表達減少 (P=0.02)。與Wistar心肌梗死組相比,GK心肌梗死組BNIP3 蛋白表達增加 (P=0.008)。見圖1及表3。

注：1. Wistar假手術組;2. Wistar心肌梗死組;3. Wistar心肌梗死+氯化鈷處理組;4. GK假手術組;5. GK心肌梗死組;6. GK心肌梗死+氯化鈷處理組

2.3 BNIP3 mRNA表達 在Wistar大鼠中,與Wistar假手術組相比,Wistar心肌梗死組及Wistar心肌梗死+氯化鈷處理組BNIP3 mRNA表達明顯增加(P<0.01)。但Wistar心肌梗死組與Wistar心肌梗死+氯化鈷處理組相比BNIP3 mRNA表達無差異(P=0.726)。而在GK糖尿病大鼠中,與GK假手術組相比,GK心肌梗死組及GK心肌梗死+氯化鈷處理組BNIP3 mRNA表達增加(P<0.01),并且與GK心肌梗死組比較,GK心肌梗死+氯化鈷處理組BNIP3 mRNA表達減少,二者之間具有統計學意義(P=0.014)。GK心肌梗死組與Wistar心肌梗死組相比,GK心肌梗死組BNIP3 mRNA表達增加,二者之間差異顯著(P=0.006)。見圖2及表3。

3 討論

近年研究發現細胞凋亡在缺血性心臟病的發生發展中發揮重要作用,在心肌梗死早期,細胞凋亡是心肌細胞死亡的主要形式,細胞壞死跟隨在細胞凋亡之后,凋亡在早期心室重構中起重要作用。而在心肌梗死后期,仍然有心肌細胞凋亡存在,且與進行性心室重構、心力衰竭密切相關[2-3]。

注：1. Wistar假手術組;2. Wistar心肌梗死組;3. Wistar心肌梗死+氯化鈷處理組;4. GK假手術組;5. GK心肌梗死組;6. GK心肌梗死+氯化鈷處理組

注:與假手術組比較,**P<0.01;與相同處理方法Wistar組比較,△△P<0.01;與心肌梗死組比較,▲P<0.05

高血糖是糖尿病的一個主要的病理因素,高血糖引起靜脈、動脈和外周神經的各種病理改變。在培養的牛主動脈內皮細胞,高血糖引起損傷的病理機制涉及:葡萄糖誘導的蛋白激酶C亞型的激活,葡萄糖衍生的高等糖化終產物(AGEs)生成增加,通過醛糖還原酶通路葡萄糖流出增加[4]。高血糖增加活性氧簇(ROS)的產生,而ROS的產生增加可以被電子傳遞鏈復合體Ⅱ、氧化磷酸化解偶聯劑、解偶聯蛋白-1和二氧化錳超氧化物歧化酶阻斷,線粒體ROS恢復正常水平阻止葡萄糖誘導的蛋白激酶C亞型的激活AGEs生成、山梨(糖)醇積聚和核因子-κB(NF-κB)激活[5]。越來越多的證據表明線粒體電子傳遞鏈過氧化物的過多產生可能在糖尿病合并癥的病理機制中起著主要和關鍵的作用[5-6]。

鈷作為體內的一個微量元素,在元素周期表中屬于ⅧB族。多項研究表明氯化鈷處理可以降低糖尿病大鼠血糖[7],其可能的機制有多種:氯化鈷可以引起STZ糖尿病大鼠GLUT1表達增加[8],增強大鼠葡萄糖轉運[9],抑制糖原異生作用[10],恢復STZ 糖尿病大鼠肝糖原水平而對肌糖原沒有影響[11]，氯化鈷降低STZ 糖尿病大鼠肝臟、心臟和大動脈的脂質過氧化反應[12-13]。本研究結果顯示:氯化鈷降低糖尿病大鼠血糖,而不降低非糖尿病大鼠血糖,考慮的機制可能與降低高血糖引起的氧化應激反應以及增加胰島素敏感性有關。

BNIP3是一個缺氧誘導的凋亡調節蛋白,由缺氧誘導因子1(hypo inducible factor 1, HIF-1)誘導表達[14-15]。HIF-1α可通過增加一些促凋亡蛋白的表達,介導缺氧誘導的細胞凋亡。Bcl-2家族中的多個調節蛋白如Bak和Bax等都在HIF-1介導的凋亡中發揮作用。BNIP3是屬于Bcl-2家族BH3-only結構域亞家族的一個線粒體促凋亡蛋白,可因缺氧或HIF-1α過表達而激活[16]。正常情況下BNIP3在大多數組織檢測不到,在多種細胞缺氧可強烈誘導BNIP3表達[17-19]。

本實驗結果表明,GK糖尿病大鼠及其對照Wistar大鼠在心肌梗死后,其缺血壞死區BNIP3表達均增加,說明缺氧可以誘發和加重心肌細胞凋亡,而慢性氯化鈷處理可以降低GK糖尿病大鼠血糖,同時降低BNIP3在缺血壞死區的表達。本實驗結果表明冠心病合并糖尿病的病人,積極控制血糖對于缺血心肌可以起到積極的調節和保護作用,可以改善病情及預后,這有助于改善心功能并降低心肌梗死的死亡率。

總之,通過慢性氯化鈷處理降低糖尿病大鼠血糖,可能減輕高血糖引起的缺氧心肌氧化應激反應和增加缺氧心肌對胰島素的敏感性,并減少BNIP3凋亡基因在GK糖尿病大鼠心肌缺血壞死區的表達,可以改善心臟功能,并改善預后和降低心肌梗死的死亡率,為冠心病合并糖尿病患者積極控制血糖提供了理論基礎和科學依據。

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Expression of BNIP3 and effect of cobalt chloride in GK diabetic rats with myocardial infarction

WANGYu-jie.DepartmentⅡofVeteranOfficers’Wards,GeneralHospitalofShenyangMilitaryAreaCommand,PLA,Shenyang110015,China;QIGuo-xian,ZHENGXiao-wei.CardiovascularDepartmentofFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China.

Objective To investigate the expression of BNIP3 gene in GK diabetic rats with myocardial infarction, and to explore the effect of chronic treatment of cobalt chloride on blood glucose and cardiomyocytes apoptosis in myocardial infarction models of diabetic rats and non-diabetic rats. Methods The experiments were carried out in male GK(Goto-kakizaki) diabetic rats and male Wistar rats (both weighing 200-250 g). Left anterior descending coronary artery (LADCA) was ligated with silk ligature in anesthetized rats. Rats were divided into six groups and raised with different treatments for 3 weeks. Before and 3 weeks after operation, the level of blood glucose of each rat was measured. Three weeks after operation, the hearts of the rats were excised, then BNIP3 expression was detected in all groups. Results Compared with GK sham-operated group and GK operated group, the level of blood glucose of GK operated group treated with cobalt chloride decreased; Compared with GK operated group, BNIP3 expression in GK operated group treated with cobalt chloride decreased; Compared with Wistar sham-operated group and Wistar operated group, blood glucose didn’t significantly change in Wistar operated group treated with cobalt chloride; Compared with Wistar operated group, BNIP 3 expression didn’t change in Wistar operated group treated with cobalt chloride. Conclusions Chronic treatment with cobalt chloride can decrease the level of blood glucose in GK diabetic rats, and also decrease BNIP3 expression in ischemic zone and necrosis of GK diabetic rats, which indicate high blood glucose may promote cardiomyocytes apoptosis, and decreasing high blood glucose can decrease cardiomyocytes apoptosis.

BNIP3; diabetic rats;myocardial infarction; cardiomyocytes apoptosis

國家自然科學基金資助課題(30500212)

110015遼寧省沈陽市，中國人民解放軍沈陽軍區總醫院第二干部病房(王聿杰); 110001遼寧省沈陽市，中國醫科大學附屬第一醫院心血管內科(齊國先，鄭曉偉)

R 587.1

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.07.010

2014-10-20)