己糖激酶-Ⅱ在乳腺癌組織中的表達及其臨床意義

李泉源 魏澗 嚴(yán)禮琴 王群

己糖激酶-Ⅱ在乳腺癌組織中的表達及其臨床意義

李泉源 魏澗 嚴(yán)禮琴 王群

目的 探討己糖激酶-Ⅱ在乳腺癌及癌旁正常乳腺組織中的表達與臨床意義。 方法 收集2002年7月至2009年7月在我院接受手術(shù)治療的71例乳腺癌患者的手術(shù)標(biāo)本，所有腫瘤組織均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢測結(jié)果證實，通過免疫組織化學(xué)方法檢測己糖激酶-Ⅱ蛋白在乳腺癌及癌旁正常組織中的表達，并探討其表達量與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。 結(jié)果 乳腺癌組織中己糖激酶-Ⅱ的陽性表達率為70.4%，顯著高于癌旁正常乳腺組織中的11.3% (P<0.05)；進一步研究發(fā)現(xiàn)，己糖激酶-Ⅱ的陽性表達情況與乳腺癌患者的年齡、腫瘤大小、分化程度和病理類型無關(guān)，與患者的有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)(P<0.05)；己糖激酶-Ⅱ陽性表達的患者5年生存率顯著低于陰性表達的患者(P=0.026)。 結(jié)論 己糖激酶-Ⅱ在乳腺癌組織中的表達明顯升高，對乳腺癌患者的預(yù)后判斷具有重要意義。

乳腺癌； 己糖激酶-Ⅱ; 靶向治療

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，在我國的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢[1]，目前在臨床上主要采取以手術(shù)為主,輔以化療、放療和內(nèi)分泌治療的綜合性治療。近年來隨著乳腺癌改良根治術(shù)的逐步推廣，手術(shù)切除范圍的縮小，化療已經(jīng)成為乳腺癌治療中的常規(guī)性手段[2]。然而，現(xiàn)有的化療藥物存在較大的細胞毒性，因此，尋找新型、高效的靶向性藥物對于其治療具有重要意義。己糖激酶-Ⅱ(Hexokinase Ⅱ)已經(jīng)證實在多種腫瘤組織中高表達，本文通過研究其在乳腺癌組織中的表達，以期為乳腺癌的治療提供新的思路和方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2002年7月至2009年7月在我院接受手術(shù)治療并經(jīng)過術(shù)后病理證實的乳腺癌患者71例，入選患者年齡35～79歲，平均(56.0±7.6)歲，分別選取乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織各71塊進行分析。本研究經(jīng)過我院倫理委員會批準(zhǔn)，患者術(shù)前均簽署知情同意書。收集的資料包括患者姓名、年齡、術(shù)前術(shù)后輔助檢查的結(jié)果、病理分期和治療情況等。本研究對象中排除術(shù)前接受過放療、化療治療的患者，所有患者每隔2月通過電話或者來院隨訪，隨訪期限為5年。

1.2 免疫組織化學(xué)和HE染色 取乳腺癌術(shù)中切除的新鮮腫瘤組織標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，行常規(guī)石蠟包埋，石蠟標(biāo)本行4 μm厚連續(xù)切片，60 ℃烤片8 h備用。將石蠟切片脫蠟和水化，PBS沖洗3次，每次3 min。蒸餾水浸泡沖洗后行抗原修復(fù)，用EDTA緩沖液100 ℃修復(fù)20 min，自然冷卻至室溫。蒸餾水沖洗2次后，PBS沖洗2次，每次3 min。滴加過氧化酶阻斷溶液，室溫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3 min。滴加動物非免疫血清，室溫孵育10 min，傾去。滴加一抗己糖激酶-Ⅱ(購自美國santa cruz公司，1∶50稀釋)，室溫孵育60 min，陰性對照用PBS代替。PBS沖洗3次，每次3 min。滴加生物素標(biāo)記的二抗 (美國santa cruz公司，羊抗兔IgG)，室溫孵育10 min。PBS沖洗3次，每次3 min。滴加5 μl鏈霉菌抗生物素一過氧化物酶溶液，室溫孵育30 min。PBS沖洗3次，每次3 min。DAB顯色劑顯色。自來水沖洗后，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗返藍，酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。HE染色按照標(biāo)準(zhǔn)流程操作。

免疫結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照以往文獻[3-4]，采用半定量積分法，由3位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師分別判讀，采用雙盲法對每張切片在高倍鏡下(×400)計數(shù)15個視野，平均100個細胞中己糖激酶-Ⅱ陽性細胞的個數(shù)作為陽性細胞率。免疫組化陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為細胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒，評分標(biāo)準(zhǔn)：陰性為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。最終結(jié)果判定：0～2分為陰性，3分為陽性；陽性細胞的百分比判斷標(biāo)準(zhǔn): 0～5%為陰性表達，6%～25%為弱陽性，26%～75%為中度陽性，>76%為強陽性，弱陽性、中度陽性和強陽性定義為陽性結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計數(shù)資料采取χ2檢驗，用Kaplan-Meier 法進行生存分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 己糖激酶-Ⅱ蛋白在乳腺癌組織中的表達 乳腺癌組織中己糖激酶-Ⅱ的染色主要為胞漿陽性，染色為淡黃色、棕黃色和棕褐色，己糖激酶-Ⅱ陽性細胞在癌旁正常組織中明顯減少 (圖1)，統(tǒng)計結(jié)果表明己糖激酶-Ⅱ在乳腺癌組織中的陽性率高達70.4%(50例)，顯著高于癌旁正常乳腺組織的11.3%(8例)(P<0.05)。

圖1 乳腺癌和癌旁正常組織中己糖激酶-Ⅱ的免疫組織化學(xué)染色檢測結(jié)果(×400)

2.2 己糖激酶-Ⅱ蛋白的表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 己糖激酶-Ⅱ的陽性表達率與乳腺癌患者的年齡、腫瘤大小、病理分型和分化程度無關(guān)(P>0.05)，與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)(P<0.05)。見表1。

表1 己糖激酶 Ⅱ與乳腺癌患者臨床病理特征間的關(guān)系(n,n=71)

組別己糖激酶Ⅱ陽性例數(shù)陰性例數(shù)P年齡(歲)<5019120.14≥50319腫瘤大小<3cm30120.92≥3cm209病理分型導(dǎo)管癌26100.97小葉癌146髓樣癌72混合癌33TNM分期Ⅰ期5100.004Ⅱ期197Ⅲ期264分化程度高分化1050.61中分化2210低分化186淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有2630.006無2418

2.3 己糖激酶-Ⅱ蛋白的表達與乳腺癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系 己糖激酶-Ⅱ陽性表達的患者中位生存期為32月，陰性表達的患者中位生存期為52.5月。己糖激酶-Ⅱ陰性表達的乳腺癌患者5年生存率明顯高于己糖激酶-Ⅱ陽性表達的患者(P<0.05)。見圖2。

圖2 己糖激酶-Ⅱ蛋白陽性表達患者和陰性表達患者的Kaplan-Meier生存曲線圖

3 討論

與正常組織相比，腫瘤組織的能量代謝發(fā)生明顯改變：正常的組織細胞主要通過葡萄糖的有氧分解獲取能量，腫瘤細胞內(nèi)由于酶譜的變化，即使在有氧條件下也以無氧酵解獲取能量[5]。己糖激酶是腫瘤組織中糖酵解的限速酶，在腫瘤組織中其表達量和活性明顯增加，從而使腫瘤組織在無氧條件下也能通過無氧酵解來保證足夠的能量來源[6]。此外，糖酵解的中間產(chǎn)物可以被腫瘤組織利用，用來合成腫瘤生長的必要物質(zhì)。己糖激酶是糖酵解的第1個限速酶，一共有4種亞型，Ⅱ型是胰島素敏感型，正常情況下僅在人體內(nèi)的肌肉和脂肪組織中呈現(xiàn)少量表達，并且多數(shù)以游離形式存在于細胞質(zhì)中，研究發(fā)現(xiàn)在肝癌、肺癌及宮頸癌組織中己糖激酶-Ⅱ的表達明顯增加，以線粒體結(jié)合型為主，且在腫瘤中心部位的表達量顯著高于腫瘤周邊部位，與低氧狀態(tài)下誘導(dǎo)其表達相關(guān)[7]。此外，研究發(fā)現(xiàn)己糖激酶-Ⅱ的表達量與腫瘤的惡性程度存在顯著正相關(guān)性[3]。體外細胞實驗和動物體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)己糖激酶-Ⅱ在腫瘤組織的發(fā)生、發(fā)展和侵襲中發(fā)揮重要的作用，靶向己糖激酶-Ⅱ的治療已經(jīng)成為多種腫瘤治療的熱點[8]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，己糖激酶-Ⅱ在乳腺癌患者腫瘤組織中的表達量明顯升高，這與以往研究結(jié)果一致[9]，進一步研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中己糖激酶-Ⅱ的表達與患者的臨床分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與年齡、分化程度、病理類型無關(guān)，說明己糖激酶-Ⅱ升高是乳腺癌腫瘤組織中的共性，同時是影響患者的臨床預(yù)后的重要因素，目前，已經(jīng)研發(fā)出多種己糖激酶-Ⅱ的抑制劑，最近的一項研究表明己糖激酶-Ⅱ的選擇性抑制劑3-BrPA可以顯著抑制乳腺癌細胞中ATP的產(chǎn)生和上調(diào)氧化應(yīng)激的水平[10]，從而抑制乳腺癌細胞的增殖和凋亡[11]，提示靶向己糖激酶-Ⅱ的藥物對于乳腺癌的治療可能具有重要意義，未來需要在體內(nèi)動物實驗中進一步研究己糖激酶-Ⅱ?qū)θ橄侔┑闹委熥饔?，以期為臨床上乳腺癌的治療打下堅實的理論基礎(chǔ)。

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Expression of Hexokinase Ⅱ in breast carcinoma and correlation with the clinicopathologic characteristics

LIQuan-yuan,WEIJian,YANLi-qin.DepartmentofBreastSurgery,DongfengHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China;WANGQun.TaiheHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China

Objective To investigate the expression of Hexokinase Ⅱ in breast carcinoma, and to discuss the relationship between positive expression and clinical characteristics of breast carcinoma. Methods Seventy-one patients with breast carcinoma in our hospital from July 2002 to July 2009 were included in this study. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of Hexokinase Ⅱ in breast carcinoma and normal tissues. All the specimens were confirmed by pathology. The correlation between the expression of Hexkinase Ⅱ and clinical characteristics of patients was analyzed. Furthermore, survival analysis was performed to study the relation between expression levels of Hexokinase Ⅱ and prognosis. Results The positive expression rate of Hexokinase Ⅱ in breast carcinoma and normal tissues was 70.4% and 11.3% respectively. Statistical analysis demonstrated that the positive expression rate of Hexokinase Ⅱ showed no significant correlation with age, histologic type, degrees of pathdogical differentiation and tumor size, but was related to clinical stage and lymph node metastasis (P< 0.05). According to the survival analysis the Hexokinase Ⅱ positive-expression group showed poorer overall survival rate compared with negtive-expression group (P=0.026). Conclusions The expression of Hexokinase Ⅱ is increased in breast carcinoma, and holding certain reference value for estimating prognosis of breast carcinoma patients.

breast carcinoma; Hexokinase Ⅱ; target treatment

湖北省教育廳課題(Q20132107)

442000湖北省十堰市，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院乳腺外科(李泉源，魏澗，嚴(yán)禮琴)；442000湖北省十堰市，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院(王群)

魏澗，Email：weij4203@163.com

R 541.6

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.07.018

2014-09-15)