表沒食子兒茶素沒食子酸酯通過抑制Akt信號通路誘導大腸癌細胞凋亡

計春燕 譚詩云

表沒食子兒茶素沒食子酸酯通過抑制Akt信號通路誘導大腸癌細胞凋亡

計春燕 譚詩云

目的 探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對大腸癌細胞系HT-29細胞增殖和凋亡的影響及可能的作用機制。 方法 體外培養(yǎng)的HT-29細胞,分為對照組和實驗組,實驗組和對照組加入同等體積的培養(yǎng)基,實驗組用不同濃度(15～120 μg/ml)EGCG分別處理24、48、72 h,MTT比色法測定其對HT-29細胞增殖的影響;EGCG(濃度分別為0、15、30、60 μg/ml)處理HT-29細胞48 h后,流式細胞儀檢測細胞凋亡,分光光度計檢測Casepase-9相對活性,Rho123探針染色流式細胞儀檢測線粒體膜電位變化,Western blot法檢測Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt、p-GSK-3β的表達。 結(jié)果 EGCG能有效抑制HT-29細胞增殖,且呈劑量和時間依賴性;EGCG(15、30、60 μg/ml)作用于HT-29細胞48 h后,細胞凋亡率分別為11.6%、23.4%、34.5%;Bax表達量上調(diào),而Bcl-2表達量下調(diào);Casepase-9相對活性顯著增加;線粒體膜電位顯著降低;此外,EGCG可抑制p-Akt及其下游蛋白p-GSK-3β的表達。 結(jié)論 EGCG可通過抑制HT-29細胞增殖并促進其凋亡,其作用機制可能與抑制Akt信號通路,繼而激活線粒體凋亡途徑相關(guān)。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯; HT-29細胞; 凋亡; Akt信號通路

大腸癌是常見的消化道惡性腫瘤,其死亡率高居腫瘤相關(guān)死亡的第2位。全球每年有>120萬的新增病例,并有>60萬大腸癌患者死亡[1-2]。隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展、人民生活水平的提高、生活方式的西方化及體力活動的減少等因素,大腸癌的發(fā)病率和死亡率逐漸上升。大腸癌治療方法以手術(shù)切除為主,輔以化療,但常規(guī)的化療藥物毒性大且常出現(xiàn)耐藥性,因此尋找具有抗腫瘤活性的天然化合物成為國內(nèi)外研究熱點。近年來研究發(fā)現(xiàn)綠茶中富含兒茶素,其具有多種藥理學活性,包括抗腫瘤、抗炎、降血壓、降脂、降血糖及抗氧化等。其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechingallate, EGCG)是兒茶素中含量最高、活性最強的單體,國內(nèi)外研究證實,EGCG對前列腺癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞均有抑制作用[3-5]。

Akt信號通路在細胞代謝、增殖、凋亡及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要調(diào)控作用,過度激活的Akt通路可促進細胞增殖并抑制細胞凋亡[6-7]。本研究旨在探討EGCG對大腸癌HT-29細胞增殖和凋亡的影響,探討其對Akt信號通路的影響,并分析其作用機制,以期為臨床應用提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 大腸癌細胞HT-29細胞購自中國科學院上海細胞庫;EGCG、羅丹明123(Rhodamine 123, Rho123)購自sigma公司;AnnexinV/PI試劑盒購于BENDER公司;胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液購于碧云天生物技術(shù)研究所;MTT試劑盒、辣根酶標記山羊抗兔或山羊抗鼠IgG購于武漢谷歌生物科技有限公司;Caspase-9活性檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;Akt, p-Akt (Ser473), p-GSK-3β (Ser9), Bax, Bcl-2 及β-actin抗體購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):HT-29細胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液中(含10%小牛血清,100 U/ml青霉素,100 μg/ml鏈霉素),置于37 ℃,飽和濕度,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),根據(jù)生長情況2～3 d傳代1次,取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 MTT比色法檢測細胞活力:取對數(shù)生長期的HT-29細胞,調(diào)整細胞濃度(1×104/ml)種于96孔板內(nèi),每孔200 μl,細胞貼壁后分為對照組和實驗組,實驗組換EGCG終濃度為15、30、60、120 μg/ml的培養(yǎng)液,對照組加入等量的培養(yǎng)液,每組5個復孔,并設(shè)置調(diào)零孔(不含細胞孔中加入等量的培養(yǎng)液)。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h,于實驗結(jié)束前4 h每孔加入20 μl MTT溶液,繼續(xù)孵育4 h,小心吸掉上清,每孔加150 μl DMSO,搖床上振蕩10 min,結(jié)晶充分溶解后酶標儀上檢測490 nm處的吸光值(A值),根據(jù)公式計算細胞活力:細胞活力(%)=[(實驗組平均A值-調(diào)零孔A值)/(對照組平均A值-調(diào)零孔A值)]×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡:將對數(shù)生長期細胞(濃度為1×106/ml)接種于6孔板中,貼壁后分為對照組和實驗組,實驗組加入含EGCG(終濃度為0、15、30、60 μg/ml)的培養(yǎng)液,對照組加入等量培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,收集細胞,離心、洗滌后加入AnnexinV-FITC 和PI,室溫避光染色。篩網(wǎng)過濾后送上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 分光光度法檢測Caspase-9活性變化:細胞接種及分組同上,收集細胞,分別加入50 μl冷裂解緩沖液,冰浴裂解15 min,然后4 ℃,1200 r/min離心15 min,將上清移至預冷的離心管中,置于冰上,取5 μl用BCA法測定蛋白濃度,取50 μl調(diào)好蛋白濃度(2～4 g/L),加入20 μl緩沖液吹打均勻,加入5 μl Caspase-9反應底物Ac-LEHD-pNA,細胞培養(yǎng)箱中避光孵育4 h,酶標儀上405 nm處測定吸光值(A405)。

1.2.5 Rho123染色流式細胞儀檢測細胞線粒體膜電位水平:細胞接種及分組同上,收集細胞,PBS漂洗3次,重懸于1 ml的1 μg/ml Rho123中,放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育30 min。PBS再洗滌3次,用EPICS-XL型流式細胞儀以507 nm為激發(fā)波長,529 nm為發(fā)射波長測定細胞內(nèi)熒光強度。

1.2.6 western blot檢測Akt、 p-Akt (Ser473)、p-GSK-3β (Ser9)、Bax、Bcl-2蛋白表達變化:細胞接種及分組同上,收集細胞,參照細胞漿蛋白抽提試劑盒的說明書提取細胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,蛋白樣品加入1/5體積的5×上樣緩沖液,沸水煮沸5 min后上樣(20 μg/孔),行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別加入1∶1000稀釋的兔抗或鼠抗人Akt、 p-Akt (Ser473)、 p-GSK-3β (Ser9)、 Bax及Bcl-2蛋白,4 ℃過夜,β-actin作為內(nèi)參,TBST洗膜后加入1∶1000稀釋的辣根酶標記的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG,室溫孵育2 h,再次洗膜后加入ECL發(fā)光液顯色,觀察各條帶深淺變化。

1.3 統(tǒng)計學分析 所有資料經(jīng)SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理,計量資料以均數(shù)±標準差表示,兩樣本間參數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗,以P< 0. 05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 EGCG對HT-29細胞活力的影響 EGCG在15～120 μg/ml濃度范圍內(nèi)均能抑制HT-29細胞的活力,且隨著藥物濃度的增加,抑制作用越明顯,同一藥物濃度,隨著作用時間的延長,細胞活力亦逐漸降低,呈顯著的劑量和時間依賴效應。見表1。

表1 EGCG對HT-29細胞活力的影響

注:與EGCG 0 μg/ml比較,*P<0.05

2.2 EGCG對HT-29細胞凋亡的影響 HT-29細胞經(jīng)EGCG處理后行流式細胞儀凋亡檢測結(jié)果顯示,EGCG(15、30、60 μg/ml)處理后,細胞凋亡率較對照組的凋亡率(2.3%)明顯升高,分別為11.6%、23.4%、34.5%。見圖1。

圖1 EGCG對HT-29細胞凋亡率的影響

2.3 EGCG對HT-29細胞Bax、Bcl-2表達的影響 Western blot結(jié)果顯示,EGCG(15、30、60 μg/ml)作用HT-29細胞48 h后,Bax蛋白表達隨著藥物濃度的升高也逐漸增加,而Bcl-2蛋白表達量則逐漸降低,呈濃度依賴性。見圖2。

2.4 EGCG對HT-29細胞Caspase-9活性的影響 Caspase-9活性檢測結(jié)果顯示,EGCG(15、30、60 μg/ml)處理后,HT-29細胞Caspase-9相對活性分別為0.177±0.04、0.231±0.05和0.306±0.04,與對照組(0.108±0.03)比較,Caspase-9相對活性明顯升高(P<0.05)。

2.5 EGCG對HT-29細胞線粒體膜電位的影響 細胞

圖2 EGCG對HT-29細胞Bax、Bcl-2表達的影響

線粒體膜電位檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),EGCG(15、30、60 μg/ml)處理48 h后,HT-29細胞線粒體熒光強度隨著藥物濃度的升高逐漸降低,分別為76.48±2.34、56.32±2.46、37.76±2.16(P<0.05);Rho123熒光強度值可間接反映線粒體膜電位(MMP)相對強度。結(jié)果顯示EGCG能降低HT-29細胞的線粒體膜電位。

2.6 EGCG對HT-29細胞Akt信號通路的影響 EGCG(15、30、60 μg/ml)作用HT-29細胞48 h后,Western blot 檢測Akt信號通路相關(guān)蛋白,細胞總的Akt表達量沒有變化,而p-Akt表達減少,同時,Akt下游效應蛋白p-GSK-3β表達也減少,且呈濃度依賴性。表明EGCG能抑制Akt磷酸化,并抑制下游蛋白的活性,即抑制Akt信號通路。見圖3。

圖3 EGCG對HT-29細胞Akt信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

3 討論

細胞凋亡是維持多細胞機體平衡的一個重要生理機制,細胞過度增殖及凋亡不足在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用[8],通過抑制細胞增殖并促進細胞凋亡可能是腫瘤治療的有效途徑。本研究發(fā)現(xiàn),EGCG在15～120 μg/ml濃度范圍內(nèi)均能有效抑制HT-29細胞的增殖,且隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長,抑制作用亦逐步增強,呈明顯的劑量和時間依賴效應。此外,本研究進一步探討了EGCG對是否通過促進細胞凋亡發(fā)揮抑制細胞的增殖作用。流式細胞儀結(jié)果顯示,EGCG處理HT-29細胞后,細胞凋亡率明顯升高。提示EGCG能抑制大腸癌細胞增殖并誘導細胞凋亡。

細胞凋亡是程序化、多基因調(diào)控的細胞死亡過程,凋亡過程受到凋亡促進蛋白和凋亡抑制蛋白的共同調(diào)節(jié)及其相互間協(xié)調(diào)。Bcl-2是一種內(nèi)膜蛋白,主要存在于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜上,Bcl-2在多種腫瘤細胞中表達,是公認的強效凋亡抑制分子,主要是通過增強線粒體膜電位,保持線粒體內(nèi)外膜的完整性,及抑制鈣離子釋放,阻止核酸內(nèi)切酶活化等機制發(fā)揮抗凋亡作用[9-11];Bax亦屬于Bcl-2家族成員,但其與Bcl-2作用相反,Bax可直接激活死亡效應因子Caspase或改變細胞膜通透性引起細胞色素C釋放某些離子和小分子通過細胞膜,進而促進細胞凋亡[12]。細胞Bcl-2和Bax比例改變可調(diào)控細胞凋亡發(fā)生與否[13],當Bcl-2占優(yōu)勢時,細胞具有抗凋亡作用,反之,當Bax表達上調(diào)時,細胞易被誘導凋亡。本研究發(fā)現(xiàn),HT-29細胞經(jīng)EGCG處理48 h后,細胞Bax蛋白表達量逐漸升高,而Bcl-2蛋白表達量則逐漸降低,呈濃度依賴性。同時細胞線粒體膜電位降低,Caspase-9活性顯著升高。Caspase家族的激活在細胞凋亡過程中扮演著至關(guān)重要的角色,被認為是誘發(fā)細胞凋亡的直接效應物。Caspase-9作為線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵酶,處于Caspase“瀑布式”激活的頂端,其活化可進一步激活Caspase-3,后者是細胞凋亡的“執(zhí)行器”,其活化標志著凋亡進入不可逆階段[14],繼而裂解DNA修復相關(guān)分子、凋亡抑制蛋白、細胞外基質(zhì)蛋白和骨架蛋白等,最終促進細胞凋亡。這些結(jié)果提示EGCG可能通過線粒體途徑誘導HT-29細胞凋亡。

本研究進一步探討了EGCG引起凋亡的機制。Akt及p-Akt在多種類型的腫瘤中過表達,p-Akt是Akt的活化形式,活化的Akt在介導細胞生長、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、凋亡、抵抗化療、放療等方面有重要作用[15-16]。Akt磷酸化激活后,可對下游相關(guān)蛋白包括BAD、Caspase-9、GSK-3β、NF-κB等進行調(diào)節(jié),最終促進細胞增殖并抑制細胞凋亡。Akt激活后可使BAD磷酸化,后者與Bcl-2或Bcl-xL解聚,游離的Bcl-2發(fā)揮凋亡抑制作用[17]。此外,Akt信號通路可直接或間接調(diào)控其他信號通路[18],因此,抑制Akt信號通路可能成為腫瘤治療的有效方法。本研究發(fā)現(xiàn),EGCG處理HT-29細胞后,細胞總Akt表達量沒有變化,而p-Akt表達減少,同時,Akt下游效應蛋白p-GSK-3β表達也減少。表明EGCG能抑制Akt信號通路。

總之,本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGCG可抑制HT-29細胞增殖,并促進細胞凋亡,其機制可能與EGCG抑制Akt信號通路,繼而激活線粒體凋亡途徑相關(guān)。EGCG的潛在作用機制尚需進一步探索和研究,作為前景廣闊的抗腫瘤藥物,EGCG有望能成為高效低毒的抗腫瘤藥物，單獨或與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合應用于臨床。

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EGCG induces cell apoptosis through inhibiting Akt signaling pathway in HT-29 colorectal cancer cells

JIChun-yan.DepartmentofGastroenterology,HubeiXinhuaHospital,Wuhan430015,China;TANShi-yun.DepartmentofGastroenterology,People’sHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China

Objective To investigate the effect of epigallocatechingallate (EGCG) on cell proliferation and apoptosis in colorectal cancer line HT-29 cells and to explore the possible mechanisms. Methods HT-29 cells were cultured in vitro, and were divided into two groups, control group and drug-treated group. The control group received only the culture medium. After treatment by EGCG at different concentrations respectively at different time, the cell survival was determined by MTT method. Apoptosis was detected by flow cytometry. The relative activity of caspase-9 was monitored by spectrophotometer. The mitochondrial membrane potential was evaluated by flow cytometry analysis after Rho123 probe staining. Western blot was used for Bcl-2, Bax, Akt, p-Akt and p-GSK-3β protein analysis. Results From the data of MTT, the cell proliferation of HT-29 cells was inhibited by EGCG at a dose-dependent and time-dependent manner. Flow cytometry analysis showed that EGCG significantly induced cell apoptosis. After treatment with EGCG(15,30,60 μg/ml) , the apoptosis rate of HT-29 cells was 11.6%, 23.4%, 34.5%, which showed an obvious concentration-effect relationship. The treatment with EGCG promoted the expression of pro-apoptotic factor Bax, and suppressed the expression of anti-apoptotic factor Bcl-2. The relative activity of caspase-9 of EGCG group was increased. Furthermore, the mitochondrial membrane potential was reduced. The data of western blot showed that EGCG decreased the expression of p-AKT and downstream effector of Akt, p-GSK-3β at a dose-dependent manner. Conclusions EGCG inhibits the cell proliferation and induces cell apoptosis of HT-29 cells, and the effects of antitumor may be associated with inhibition of the Akt signaling pathway, thus activating mitochondria apoptosis pathway.

epigallocatechingallate; HT-29 cell; apoptosis; Akt signaling pathway

湖北省自然科學基金課題(302-131854)

430015湖北省武漢市,湖北省新華醫(yī)院消化內(nèi)科(計春燕);430060湖北省武漢市,武漢大學人民醫(yī)院消化內(nèi)科(譚詩云)

R 735.34

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.07.019

2014-08-15)