吡格列酮在大鼠放射性肺纖維化中保護作用的研究

吳 榮，孫宇楠，張振勇，曾越燦，曹 碩

吡格列酮在大鼠放射性肺纖維化中保護作用的研究

吳 榮*，孫宇楠，張振勇，曾越燦，曹 碩

目的 探討吡格列酮在放射性肺纖維化中的保護作用，以及對AT1R(血管緊張素Ⅱ 1型受體表達的影響。方法 SD大鼠60只，共分為5組。空白組：不接受任何干預；照射+安慰劑組：接受12 Gy照射+安慰劑干預；單獨給藥組：接受吡格列酮10 mg/(kg·d)干預；照射+吡格列酮a組：接受12 Gy照射+吡格列酮10 mg/(kg·d)干預；照射+吡格列酮b組：接受12 Gy照射+吡格列酮20 mg/(kg·d)干預。采用HE及Masson染色觀察大鼠肺組織纖維化情況；采用免疫組化觀察AT1R在肺組織中的分布情況；采用蛋白免疫印跡雜交及RT-PCR檢測AT1R蛋白及mRNA的表達情況。結果 HE及Masson染色顯示，受照射大鼠肺組織細胞出現變性、壞死，肺組織出現明顯纖維化；大鼠給予吡格列酮干預后，受照射大鼠的肺組織損傷減輕，肺組織纖維化減輕；免疫組化提示，照射后大鼠肺組織及上皮細胞中AT1R表達較空白組及單獨給藥組明顯，照射+吡格列酮組的AT1R表達較照射+安慰劑組少；Western blot及RT-PCR提示，接受吡格列酮干預的受照射大鼠，AT1R蛋白及mRNA表達水平被明顯抑制。結論 吡格列酮在放射性肺纖維化中具有保護作用，其可能通過下調AT1的表達來實現對放射性肺損傷的保護作用。

放射性肺纖維化；吡格列酮；血管緊張素Ⅱ 1型受體；過氧化物酶體增殖物激活受體γ

0 引言

放射治療是胸部惡性腫瘤的主要治療方式之一，放射性肺損傷是胸部腫瘤放療的常見不良反應。放射性肺纖維化是放射性損傷的晚期并發癥，可導致呼吸困難，影響患者的生活質量，甚至導致呼吸衰竭，目前尚無特異性的肺纖維化治療手段[1]。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是核激素受體超家族的配體活化的核轉錄因子，越來越多的證據表明自然和合成的PPARγ激動劑在體外都具有強大的抗纖維化作用，吡格列酮為合成的PPARγ激動劑[2]。本課題組前期的研究提示，血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ)是放射性肺纖維化形成的重要因素[3]。Angiotensin Ⅱ的這種作用主要通過血管緊張素Ⅱ 1型受體(Angiotensin type Ⅱ 1 receptor，AT1R)實現[4]。本課題組研究提示[5]，PPARγ作為一種保護性蛋白，在未用體外激動劑的情況下，PPARγ生理性升高不足以抑制致纖維化蛋白的活性。目前尚無大鼠放射性肺纖維化模型中PPARγ對AT1R影響的研究。

放射性肺纖維化目前尚缺乏有效的治療方法，在前期研究證實血管緊張素Ⅱ在放射性肺纖維化中起重要作用的基礎上，本文擬研究吡格列酮在放射性肺纖維化中的保護作用，以及對AT1受體表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組及干預(動物模型建立) SPF級Sprague Dawley(SD)大鼠60只，雌雄各半，月齡3個月，體重178～245 g，購自中國醫科大學實驗動物中心。將75只大鼠應用隨機數字表法隨機分為5組，每組12只。空白組：不接受任何干預；照射+安慰劑組：接受12 Gy照射+安慰劑干預；單獨給藥組：接受吡格列酮10 mg/(kg·d)干預；照射+吡格列酮a組：接受12 Gy照射+吡格列酮10 mg/(kg·d)干預；照射+吡格列酮b組：接受12 Gy照射+吡格列酮20 mg/(kg·d)干預。大鼠按照100 g/0.3 mL的量給予水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉后右側胸腔彩超定位，放置于直線加速器下照射。使用6 MV高能X射線，采用前后對穿照射的方法，源皮距100 cm，右側胸腔(單側肺)彩超掃描確定照射野大小，照射劑量300 cGy/min。照射完后6 h之內，除空白組外，對所有鼠行第1次灌胃處理，照射+安慰劑組灌入2 mL蒸餾水，單獨給藥組及照射+吡格列酮組分別灌入相應量的吡格列酮。此后每天灌胃1次，每7天測量1次體重，根據體重調整灌藥量，行灌胃處理30 d，分籠飼養至3個月。

照射后3個月標本取材，用水合氯醛過量麻醉法處死大鼠，取其右側肺組織，用生理鹽水洗凈血液后，用剪刀將其橫斷，一半迅速放于4%中性甲醛固定液中固定，48 h后轉入70%乙醇中保存；另一半放入-80 ℃深凍冰箱中保存。

1.2 檢測指標

1.2.1 肺組織HE、Masson染色觀察肺損傷及纖維化情況 免疫組織化學觀察AT1表達。HE染色過程：將保存于70%乙醇中的肺組織取出，小心取下約5 mm×5 mm×5 mm大小的肺橫斷面組織放入包埋盒中，經過脫水、透明、浸蠟、包埋后制成組織蠟塊，在切片機上連續切成厚度約4 μm的組織切片，撈片，放入60 ℃烤箱中烘干備用。將片子放入100%二甲苯中脫蠟10 min×2，用無水乙醇洗去二甲苯4 min，后用95%、80%、70%乙醇各洗1 min，PBS和蒸餾水各沖洗1 min。HE特殊染色：0.2%醋酸水溶液洗10 s，5%磷鎢酸10 min，0.2%醋酸水溶液浸洗2次，2%苯胺藍液染色5 min，0.2%醋酸水溶液洗2次，梯度乙醇脫水二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察肺組織損傷情況。Masson染色過程：常規石蠟切片脫蠟后，行Masson染色，光鏡下觀察肺組織細胞呈紅色或黃色，膠原纖維呈藍綠色，拍片，掃描，采用圖像分析儀測定肺組織膠原含量。免疫組化過程：SP法免疫組化染色，染色步驟按說明書進行，抗體的工作濃度為1∶100。用磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照，用預試驗中已知的陽性片作陽性對照。

1.2.2 蛋白免疫印跡雜交(Western blotting)法檢測AT1表達 提取大鼠肺組織蛋白并測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，5%脫脂牛奶封閉2 h。一抗(小鼠抗AT1單克隆抗體)(1∶3 000)孵育PVDF，4 ℃過夜；1×TBST洗5 min×5次；將二抗(HRP標記山羊抗鼠IgG抗體)(1∶2 000)室溫孵育2 h；1×TBST洗5 min×5次；ECL顯影；以GAPDH作為內參照物，相同實驗重復3次。

1.2.3 RT-PCR(實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應)法檢測AT1 mRNA表達水平 AT1上游引物：5′-CACCTATGTAAGATCGCTT-3′，下游引物：5′-GATGATGATGCAGGTGACT-3′，擴增片段長度：162 bp；GADPH上游引物：5′-TGACATCAAGAAGGTGGTGA-3′，下游引物：5′-TCATACCAGGAAATGAGCTT-3′，擴增片段長度：177 bp。實驗步驟按說明書進行。

2 結果

2.1 動物模型建立情況 36只大鼠接受了直線加速器對右側肺的對穿照射，照射時用鉛塊(或多葉光柵)擋住除暴露右肺外的其他器官。在飼養過程中，照射+吡格列酮a組有1只大鼠在照射后死亡，照射+吡格列酮b組有1只大鼠在照射后死亡，照射+安慰劑組沒有大鼠死亡。所有經過照射的大鼠都出現體重下降明顯等癥狀。空白組沒有大鼠死亡。共有58只大鼠完成實驗：空白組12只，照射+安慰劑組12只，單獨給藥組12只，照射+吡格列酮a組11只，照射+吡格列酮b組11只。

2.2 常規HE及Masson染色結果 在×400鏡下觀察(圖1 HE染色部分)，接受照射的大鼠肺組織出現較為明顯的肺組織損傷，肺泡及支氣管上皮細胞排列紊亂，部分細胞出現變性及壞死，細胞核排列不規則，其中照射+安慰劑組(圖1c)損傷較其他照射組重，接受吡格列酮干預的大鼠肺組織損傷程度較不接受吡格列酮干預的大鼠輕。Masson染色結果提示，照射后大鼠肺組織纖維化明顯(藍色，見圖1 Masson染色部分)，照射+安慰劑組纖維化較其他組明顯(P<0.05)。接受吡格列酮干預可降低照射所引起的纖維化程度，吡格列酮干預高劑量組此效果更明顯(見圖1、表1，P<0.05)。

圖1 HE、Masson染色結果

注：a.空白組，b.單獨給藥組，c.照射+安慰劑組，d.照射+氯沙坦a組，e.照射+氯沙坦b組。肺組織HE染色提示，肺組織損傷，肺泡及支氣管上皮細胞排列紊亂，部分細胞出現變性及壞死，細胞核排列不規則，其中照射+安慰劑組損傷較其他照射組重，接受吡格列酮干預的大鼠肺組織損傷程度較不接受吡格列酮干預的大鼠輕(×400)。Masson染色結果提示，照射后大鼠肺組織纖維化明顯(藍色)，照射+安慰劑組纖維化較其他組明顯；接受吡格列酮干預可降低照射所引起的肺纖維化程度(×400)

表1 實驗后大鼠肺組織纖維化評分情況

注：*與照射+吡格列酮a或b組比較，P<0.05；#與照射+安慰劑組比較，P<0.05

2.3 免疫組化情況 AT1R免疫組化提示，照射后大鼠肺組織中肺泡及支氣管上皮細胞中AT1R表達較空白組及單獨藥物組明顯。照射+吡格列酮a組與照射+吡格列酮b組的AT1R表達較照射+安慰劑組少，提示吡格列酮在放射性肺損傷中具有保護作用。見圖2。

圖2 AT1R免疫組化結果

注：a.空白組，b.單獨給藥組，c.照射+安慰劑組，d.照射+吡格列酮a組，e.照射+吡格列酮b組。肺組織AT1R免疫組化提示，照射后大鼠肺組織及內皮細胞中AT1R表達較空白組及單獨藥物組明顯。照射+吡格列酮a組與照射+吡格列酮b組的AT1R表達較照射+安慰劑組少(×200)

2.4 Western blot結果 AT1R蛋白表達情況,照射+安慰劑組的AT1R蛋白表達較其他組明顯；照射+吡格列酮a組的AT1R蛋白表達較照射+吡格列酮b組明顯(P<0.05)，較空白組及單獨給藥組也明顯。大鼠肺組織接受放射線照射后，AT1R蛋白表達升高，吡格列酮干預可降低照射所引起的AT1R蛋白表達升高，吡格列酮干預高劑量組此效果更明顯(見圖3、圖4，P<0.05)。

圖3 AT1R蛋白表達情況

注：a.空白組，b.單獨給藥組，c.照射+安慰劑組，d.照射+吡格列酮a組，e.照射+吡格列酮b組。照射+安慰劑組的AT1R蛋白表達較其他組差異有統計學意義(P<0.05)；照射+吡格列酮a組的AT1R蛋白表達較照射+吡格列酮b組差異有統計學意義(P<0.05)，較空白組及單獨給藥組差異有統計學意義

圖4 AT1R蛋白相對表達量

注：a.空白組，b.單獨給藥組，c.照射+安慰劑組，d.照射+吡格列酮a組，e.照射+吡格列酮b組

2.5 RT-PCR結果 照射+安慰劑組的AT1 mRNA表達較其他組明顯；照射+吡格列酮a組的AT1 mRNA表達水平較照射+吡格列酮b組明顯，較空白組及單獨給藥組均明顯，提示大鼠肺組織接受放射線照射后，AT1 mRNA表達水平升高，吡格列酮干預可降低照射所引起的AT1 mRNA表達升高，吡格列酮干預高劑量組此效果更明顯(見圖5，P<0.05)，這一結論與Western blot結果一致。

圖5 RT-PCR檢測AT1 mRNA相對表達水平

注：a.空白組，b.單獨給藥組，c.照射+安慰劑組，d.照射+吡格列酮a組，e.照射+吡格列酮b組

3 討論

放射治療已被廣泛用于治療胸部惡性腫瘤，而放射性肺損傷，特別是放射性肺纖維化是影響患者生活質量甚至威脅生命的常見并發癥[6]。成纖維細胞的分化和激活是肺纖維化中的一個關鍵致病過程[2-7]。放射性肺損傷的現有治療主要為控制炎癥，長期使用糖皮質激素，期望通過對肺炎的控制來延緩肺纖維化的進程。然而這種治療無明確的益處，激素長期應用后的不良反應是重要挑戰[1]。

PPARs是核激素受體超家族的配體活化的核轉錄因子，參與脂代謝，細胞分化、增殖，細胞凋亡，炎癥等多種重要途徑[2]。PPARs分為3種亞型：PPARα、PPARβ/δ和PPARγ，而PPARγ在肺部疾病中的作用研究最具前景[8-9]。有研究提示，PPARγ在肺及心臟中具有抗纖維化作用[5,10-13]。

Ang Ⅱ是一種潛在的促纖維化介質，可誘導人肺成纖維細胞增殖和膠原蛋白的合成[14]。前期研究證實，Ang Ⅱ和TGF-β1在放射性肺纖維化中表達升高[3]。研究表明，Ang Ⅱ促進肺成纖維細胞活化增殖的作用是通過AT1R實現的[15]。AT1R信號的沉默可抑制Ⅰ型膠原蛋白的表達[16]。

某些血管緊張素受體抑制劑(ARBs)，如替米沙坦，也是PPARs的部分激動劑，表明體內AT1R的作用部分是通過PPARγ介導的[17]。血管平滑肌細胞(VSMC)的體外研究顯示，激活的PPARγ可抑制AT1R基因表達，反之亦然[18]。Zhao等[19]證明，激活PPARγ可以下調AT1R表達，從而減弱AngⅡ誘導的膠原合成導致的纖維化，在受體水平抑制RAS系統的活性。心房纖維細胞中吡格列酮可抑制AngⅡ誘導的成纖維細胞表達和增殖[20-21]。這些研究表明，PPARγ激動劑的作用有一部分是通過AT1R介導的，預示著在纖維化進程中，PPARγ和AT1R必然存在聯系。

從本實驗中可以看到，照射+安慰劑組大鼠肺組織纖維化較其他組明顯，AT1R表達也較其他組顯著，應用吡格列酮干預后，放射性肺損傷、肺纖維化減輕，且隨著給藥劑量的增加，這種作用更加明顯(圖1，表1，P<0.05)，而免疫組化提示肺組織AT1R的表達量明顯減少(圖2，P<0.05)。單獨給藥組和空白組之間無差異。Western blot和RT-PCR檢測提示，吡格列酮干預后，AT1R 蛋白及mRNA表達量降低，并且與劑量強度相關，隨著吡格列酮用量的增加，AT1R 蛋白及mRNA表達水平下降越明顯，其抗肺纖維化效果越顯著(圖3～圖5，P<0.05)。目前吡格列酮已用于臨床治療糖尿病，且有研究證實，PPARγ配體有抑制肺癌和放療增敏的作用[22]，預示著PPARγ激動劑應用于肺癌患者可能會獲得多種臨床價值。

綜上所述，吡格列酮在放射性肺損傷中具有保護作用，其可能通過下調AT1的表達來實現對放射性肺纖維化的保護作用。但是具體通過何種信號通路及機制實現這一調節過程仍需更深入的研究[22-23]。

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Protective effects of pioglitazone on radiation induced lung fibrosis

WU Rong*,SUN Yu-nan,ZHANG Zhen-yong,ZENG Yue-can,CAO Shuo

(Department of Medical Oncology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110022,China)

Objective To investigate the protective effects of pioglitazone on radiation induced lung fibrosis,and the effects on the expression of AT1 receptor.Methods Sixty SD rats were divided into 5 groups.The blank group:without any intervention.The irradiation plus placebo group:receiving 12 Gy irradiation plus placebo intervention.The single drug group:receiving only 10 mg/(kg·d) pioglitazone intervention.The irradiation plus pioglitazone a group:receiving 12 Gy irradiation plus 10 mg/(kg·d)pioglitazone intervention.The irradiation plus pioglitazone b group:receiving 12 Gy irradiation plus 20 mg/(kg·d)pioglitazone intervention.HE and Masson staining were used to observe the lung tissue injury.The distributions of AT1R in lung tissue were observed by immunohistochemistry.The expression of AT1R protein and mRNA were detected by Western blot and RT-PCR.Results HE and Masson staining indicated that the lung tissue of irradiation rats showed degeneration and necrosis,the lung tissue appeared obvious fibrosis.When the rats were treated with pioglitazone after irradiation,the lung injury and fibrosis decreased.The immunohistochemical staining showed that after irradiation,the expressions of AT1R of lung tissue was more obvious than those of blank group and the single drug group.The expressions of AT1R of irradiation plus pioglitazone group was less obvious than that of irradiation plus placebo group.The Western blot and RT-PCR indicated that after the pioglitazone intervention,the expressions of AT1 protein and mRNA of irradiation rats were significantly inhibited.Conclusion Pioglitazone has protective effects on radiation induced lung fibrosis,possibly through the down-regulation of the expression of AT1R.

Radiation induced lung fibrosis;Pioglitazone;Angiotensin Ⅱ type 1 receptor;PPARγ

2014-10-09

中國醫科大學附屬盛京醫院腫瘤科，沈陽 110022

國家自然科學基金資助項目(81201803)

10.14053/j.cnki.ppcr.201501004

*通信作者