基因工程和細胞工程中的 “篩選”問題例析

梁存喜

基因工程和細胞工程是高考的重點，其中多處涉及到篩選問題，由于教材的介紹比較簡略，很多學生對篩選的方法和原理不甚理解，在此結合具體的題目，對基因工程中目的基因和重組細胞的篩選以及細胞工程中雜種細胞的篩選進行分析，以期對學生的學習有所幫助.

一、基因工程中的篩選

1.利用DNA探針從基因文庫中篩選目的基因

例1為從根本上解決水稻中的高植酸問題，可將植酸酶基因導入水稻，培育低植酸轉基因水稻品種.圖1是獲取植酸酶基因的流程.據圖回答：

圖1（1）圖中基因組文庫（小于/等于/大于）cDNA文庫.（2）B過程需要的酶是；A、C過程中（可以/不可以）使用同一種探針篩選含目的基因的菌株.（3）目的基因Ⅰ和Ⅱ除從構建的文庫中分離外，還可以分別利用圖中和為模板直接進行PCR擴增，該過程中所用酶的顯著特點是.

解析基因組文庫是從酵母菌體內直接提取DNA構建的，cDNA文庫是由酵母菌細胞中提取的mRNA經過逆轉錄而來的，由于酵母菌細胞內可能只有部分基因表達產生mRNA，因此基因組文庫大于cDNA文庫.B過程需要的酶是逆轉錄酶；因為A、C過程都能獲得含目的基因的菌株，所以可以使用同一種探針進行篩選.目的基因Ⅰ和Ⅱ除從構建的文庫中分離外，還可以分別利用圖中DNA和cDNA為模板直接進行PCR擴增，該過程中所用的酶是耐高溫的RNA聚合酶.

答案：（1）大于（2）逆轉錄酶可以

（3）DNAcDNA耐高溫

知識鏈接基因文庫包括基因組文庫和cDNA文庫.基因文庫是一套包含特定生物體所有基因的DNA序列.其中，不同的DNA序列片段分別被克隆在適當的載體上.例如，人類基因文庫是一群帶有人類基因克隆的大腸桿菌細胞.那么我們如何從這個文庫中篩選出所需要的目的基因呢？目前，有很多

圖4（1）該放射性物質中被標記的元素是 .光合作用過程中，含標記元素的化合物被光反應提供的 還原成糖類.在適宜溫度下測得葉片光飽和點，若其他條件不變，進一步提高溫度，則該葉片光飽和點的變化是 .（2）由實驗結果推斷，幼鈴脫落顯著減少的是 組.B組幼鈴放射性強度百分比最低，說明B組葉片的光合產物 .為優化實驗設計，增設了D組（激素處理葉片），各組幼鈴的放射性強度百分比由高到低排序是 .由此可知，正確使用該激素可改善光合產物調配，減少棉鈴脫落.（3）若該激素不能促進插條生根，卻可促進種子萌發和植株增高，其最可能是 .

答案：（1）碳；NADPH（[H]）；降低 （2）C；輸出減少；C>A>B>D （3）赤霉素

創新之處考查了外源激素對植物光合產物調配的影響.

解析（1）光合產物用碳元素標記.光反應提供的[H]還原C3為糖類和C5.適宜溫度下若提高溫度，酶活性降低，光飽和點降低.（2）幼鈴脫落是光合產物不足導致，C組幼鈴中有機物占比最高，因而幼鈴脫落顯著減少.B組中葉片的放射性強度的百分比較高，說明有機物占比較多，輸出較少.由題中數據可知，激素可抑制葉片有機物的輸出，有利于幼鈴有機物的輸入，D組導致葉片有機物輸出明顯較少，且小于B組，因而幼鈴的放射性強度百分比由高到低依次為C>A>B>D.（3）促進種子萌發和植株增高，但不能促進扦插枝條生根的激素，最可能是赤霉素.（收稿日期：2014-09-20）方法能夠幫助我們從基因文庫的眾多克隆中篩選和鑒定帶有特定基因的克隆，這些方法大多是以雜交探測技術為基礎的.雜交探測是一種利用能和目的基因序列互補的DNA片段為探針，通過分子雜交的手段找出帶有目的基因的DNA片段的實驗方法.DNA探針是根據已知的有關目的基因的某些信息（部分DNA序列或蛋白質產物等）通過化學方法合成的核苷酸單鏈，制作DNA探針時，可利用目的基因的部分核苷酸序列，而無需使用全部的核苷酸序列， 因此雖然mRNA形成過程中存在加工過程，導致逆轉錄后獲得的DNA可能和原DNA不完全相同，但仍可用同一種探針進行檢測.探針要利用放射性元素或熒光色素進行標記以利于檢測.

2.利用標記基因篩選重組細胞

例2目前基因工程所用的質粒載體主要是以天然細菌質粒的各種元件為基礎重新組建的人工質粒，pBR322質粒是較早構建的質粒載體，其主要結構如圖2-a所示.

圖2（1）構建人工質粒時要有抗性基因，以便于.（2）現將pBR322質粒和目的基因經BamHⅠ處理后構建的重組質粒導入大腸桿菌細胞，為檢測重組質粒是否導入原本無ampr和tetr的大腸桿菌體內，將大腸桿菌在含氨芐青霉素的培養基上培養，得到如圖2-b的菌落.再將滅菌絨布按到培養基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含四環素的培養基上培養，得到如圖2-c的結果（空圈表示與圖2-b對照無菌落的位置）.與圖2-c空圈相對應的圖2-b中的菌落表現型是，圖2-c的結果顯示，多數大腸桿菌導入的是.

解析（1）構建人工質粒時要有抗性基因作為標記基因，以便于篩選（鑒別目的基因是否導入受體細胞）.（2）在含氨芐青霉素的培養基上培養，能夠生長的大腸桿菌具有氨芐青霉素抗性基因，這些大腸桿菌中導入了pBR322質粒或重組pBR322質粒.經BamHⅠ處理后，pBR322質粒中的四環素抗性基因被破壞.因此在含四環素的培養基上培養，能夠生長的大腸桿菌具有四環素抗性基因，這些大腸桿菌中導入了pBR322質粒而沒有導入重組pBR322質粒.能在含氨芐青霉素的培養基上生長而不能在含四環素的培養基上生長的是導入了重組pBR322質粒的大腸桿菌，而既能在含氨芐青霉素的培養基上生長又能在含四環素的培養基上生長的只能是導入了pBR322質粒的大腸桿菌.綜上分析可知，與圖2-c空圈相對應的圖2-b中的菌落是只能在含氨芐青霉素的培養基上生長而不能在含四環素的培養基上生長的大腸桿菌，表現型是能抗氨芐青霉素，但不能抗四環素.圖2-c的結果顯示，多數大腸桿菌既能在含氨芐青霉素的培養基上生長，又能在含四環素的培養基上生長，導入的是pBR322質粒.

答案：（1）篩選（鑒別目的基因是否導入受體細胞） （2）能抗氨芐青霉素，但不能抗四環素 pBR322質粒

知識鏈接用同種限制性核酸內切酶處理的目的基因和運載體具有相同的黏性末端，在DNA連接酶的作用下，如果只考慮兩個DNA片段兩兩結合，混合物中至少有3種環狀DNA：質粒自連的環狀DNA（普通質粒）、目的基因自連的環狀DNA、質粒與目的基因相連的環狀DNA（重組質粒）.由此可見，經DNA連接酶處理后，并不能保證每一個質粒都能與目的基因實現重組，因此導入受體細胞的不一定是基因工程所需要的重組質粒，也可能是普通質粒，這就需要對受體細胞進行篩選.

通常在構建基因表達載體時就要考慮到篩選的需要，質粒上需要具有特定的標記基因以利于篩選.例2中的pBR322質粒含有氨芐青霉素抗性基因和四環素抗性基因（圖2-a），因此含有普通pBR322質粒的細胞具有對四環素和氨芐青霉素的雙重抗性.如果目的基因插入到四環素抗性基因中，四環素抗性基因就會被破圖3壞，對四環素的抗性就會喪失，所以帶有重組質粒的受體細胞僅對氨芐青霉素具有抗性，對四環素沒有抗性.根據這個特點可篩選出導入重組質粒的受體細胞.篩選時首先要用一小塊滅菌的絨布固定在直徑較平板略小的圓柱形木塊上，制作一個“印章”（即接種工具，如圖3），然后采用例2第（2）小題所述的方法進行，最后從圖2-c空圈相對應的圖2-b中的菌落處分離得到所需的含有重組質粒的細胞.

二、細胞工程中的篩選

1.植物體細胞雜交技術中篩選雜種細胞

例3現有甲、乙兩個煙草品種（2N=48），其基因型 分別為rrHH和RRhh，這兩對基因位于非同源染色體上，且在光照強度大于800勒克斯時，都不能生長，這是由于它們中的一對隱性純合基因（rr或hh）作用的結果.取兩品種的花藥離體培養成植株，然后將它們的葉肉細胞制成原生質體，并將兩者相混，使之融合（只考慮2個原生質體的相互融合），誘導產生細胞團.（1）實驗開始時必須用 除去不利于原生質體融合的物質.（2）實驗中除獲得雜種細胞外，還有基因型為 的融合細胞.（3）設計一方法（不考慮機械方法），從培養液中分離出雜種細胞，方法： .在此條件下，有種細胞團不能分化；能分化的細胞團是由的原生質體融合來的.由該細胞團分化發育成的植株，其染色體數是，基因型是.

解析制備原生質體利用酶解法，即用果膠酶和纖維素酶水解細胞壁；花藥離體培養形成單倍體植株，利用其葉肉細胞制成的原生質體基因型分別是rH和Rh，如果只考慮兩兩融合的情況，除獲得雜種細胞外，還有原生質體自身融合而成的，基因型分別是rrHH、RRhh；由于隱性純合基因rr或hh的作用，在光照強度大于800勒克斯時不能生長，因此可將融合后的細胞置于大于800勒克斯光照下培養，自身融合的rrHH、RRhh不能生長，只有基因型為RrHh的雜種細胞能夠生長.

答案：（1）纖維素酶和果膠酶 （2）rrHH、RRhh （3）置于大于800勒克斯光照下培養，收集能生長的細胞團 2 甲乙兩品種 48 RrHh

知識鏈接雜種細胞的篩選沒有通用的方法，一般根據需要篩選的細胞特點進行.篩選可以用機械方法，也可以用生理學或遺傳學的方法.

2.單克隆抗體制備過程中的篩選

例4已知細胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基蝶呤阻斷.人淋巴細胞中雖有這兩種DNA的合成途徑，但一般不分裂增殖.鼠骨髓瘤細胞中盡管沒有S途徑，但能不斷分裂增殖，將這兩種細胞在試管中混合，加聚乙二醇促融，獲得雜種細胞：

（1）試管中除融合的雜種細胞外，還有 種融合細胞（只考慮兩個細胞的融合）.

（2）設計一方法（不考慮機械方法），從培養液中分離出雜種細胞，并說明原理.

方法： .原理： .

（3）欲制備治療H7N9禽流感的單克隆抗體，已知人B淋巴細胞（染色體組成為2N=46），鼠骨髓瘤細胞（染色體組成為2N=40）.那么B淋巴細胞應取自于 （正常個體、患者），雜交瘤細胞中共有 個染色體組.

解析（1）將人的淋巴細胞和鼠的骨髓瘤細胞混合后加入聚乙二醇促融，如果只考慮兩個細胞的融合，則試管中除雜種細胞外，還有2種自身融合細胞；（2）由題意可知，D途徑可被氨基蝶呤阻斷，故在培養基中加入氨基蝶呤后，只有D途徑的骨髓瘤細胞不能進行DNA復制而不能分裂增殖，B淋巴細胞雖然有S途徑，但是B細胞一般不分裂增殖，只有雜交瘤細胞中可利用B細胞的S途徑進行DNA合成而不斷增殖.（3）患者體內可分化出能夠分泌抗H7N9禽流感病毒抗體的漿細胞，故所需B淋巴細胞應取自患者，人和鼠都是二倍體，因此雜交瘤細胞中含有4個染色體組.

答案：（1）2 （2）培養液中加入氨基蝶呤，收集增殖的細胞；加入氨基蝶呤后，使D合成途徑阻斷，僅有D合成途徑的骨髓瘤細胞及其彼此融合的細胞就不能增殖，但人淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合后的雜種細胞中可以利用淋巴細胞中的S途徑合成DNA而增殖.（3）患者 4（4）液體 動物血清

知識鏈接在單克隆抗體的制備中，首先把從脾臟中分離出的B細胞（漿細胞）和骨髓瘤細胞進行融合以獲得雜交瘤細胞.

通常采用兩步操作進行：第一步采用HAT選擇培養基篩選雜交瘤細胞.HAT選擇培養基是在普通培養液中加入次黃嘌呤（H）、 氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）等物質配制而成的，已知細胞中DNA的合成存在D和S兩條途徑，其中氨基蝶呤可阻斷D途徑，骨髓瘤細胞僅有D合成途徑，B淋巴細胞雖然含有D、S兩條途徑，但是一般不增殖，這就決定了在HAT培養基中只有B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合后的雜交瘤細胞可以利用B淋巴細胞中的S途徑合成DNA而增殖，其他細胞不能增殖.由此篩選出的雜交瘤細胞可能是多種B細胞和骨髓瘤細胞融合而成的，因此需要進行第二次篩選，選出能產生特定抗體的雜交瘤細胞.二次篩選通常采用有限稀釋克隆細胞的方法，將雜交瘤細胞多倍稀釋，接種在多孔的細胞培養板上，使每孔細胞不超過一個，通過培養讓其增殖，然后利用特定抗原檢測各孔上清液中細胞分泌的抗體（常用酶聯免疫吸附試驗法），如果上清液可與特定抗原發生特異性反應（陽性反應），說明這個培養孔中的細胞就有我們需要的雜交瘤細胞.對培養孔中的細胞繼續進行有限稀釋，一般重復3～4次，保證每個孔中增殖的細胞為單克隆細胞，由此獲得 “單克隆抗體”——由一個細胞克隆而來的細胞群分泌的抗體.第二次篩選同時也是鑒定的過程.

（收稿日期：2014-02-03）