干預(yù)NF-κB信號通路對鼠腦皮層神經(jīng)元自噬的影響

莫偉 陳兵 龍霄翱 鄒新輝 梁遠(yuǎn)生

干預(yù)NF-κB信號通路對鼠腦皮層神經(jīng)元自噬的影響

莫偉 陳兵 龍霄翱 鄒新輝 梁遠(yuǎn)生

目的 研究觀察干預(yù)NF-κB信號途徑對腦皮層神經(jīng)元自噬的影響。方法 用PMA及PDTC作用于體外培養(yǎng)的大鼠腦皮層神經(jīng)元, 分別應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)熒光法測定細(xì)胞核因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)蛋白的表達(dá), 應(yīng)用Western blot檢測自噬蛋白Beclin1表達(dá)情況。結(jié)果 PMA干預(yù)下神經(jīng)元NF-κB蛋白表達(dá)及自噬指標(biāo)均呈相關(guān)性升高, 而經(jīng)PDTC處理后上述變化均受不同程度的抑制。各指標(biāo)激活及抑制程度均與藥物作用劑量與時間相關(guān)。結(jié)論 NF-κB通路活化可能是啟動大鼠腦皮層神經(jīng)元不同程度的自噬進(jìn)程的中心環(huán)節(jié), 而PDTC能夠通過抑制NF-κB通路而抑制這些進(jìn)程,但不能完全阻斷這些進(jìn)程。

PMA；PDTC；神經(jīng)元；細(xì)胞核因子κB

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)的高發(fā)生率和高致殘率所造成的社會、經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療護(hù)理負(fù)擔(dān)越來越重。因此, 創(chuàng)傷性腦損傷后病人的神經(jīng)功能恢復(fù)越來越受到重視。創(chuàng)傷性腦損傷可因腦挫裂傷、顱內(nèi)血腫、導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高、缺氧、水腫誘發(fā)腦組織酸中毒及微循環(huán)障礙等一系列的病理生理變化［1］。損傷后神經(jīng)元中的NF-κB通路被激活并表達(dá)NF-κB［2］。但是, 顱腦損傷的病理生理機(jī)制及治療方面仍存在許多爭議。本實驗研究采用神經(jīng)元體外培養(yǎng)技術(shù), 排除了顱腦外傷后眾多因素的影響, 獨立研究NF-κB通路對神經(jīng)元自噬的影響, 探討NF-κB通路參與神經(jīng)元死亡的機(jī)制,為以后臨床用藥提供新的思路。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物 Speague-Dawley(SD)大鼠200只, 由廣東醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供, SPF級, 鼠齡為24 h, 雌雄不限,體重5～8 g。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清(四季青公司), Neuronbasal培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基(GIBCO公司), PMA、PDTC、NF-κB免疫熒光試劑盒(Sigma公司)。

1.1.3 主要儀器 熒光顯微鏡(美國Kodak公司).5417R型高速臺式冷凍離心機(jī)(德國eppendorf公司), PH140A型培養(yǎng)箱、干燥器(上海一恒科技有限公司), Serial垂直轉(zhuǎn)移電泳槽、分光光度計(Bio-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 新生大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的純化培養(yǎng)：取出生24 h內(nèi)的SD大鼠, 參照McCarthy的方法加以改良建立大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng), 冰凍無菌條件下取大腦皮質(zhì), 仔細(xì)的剝除軟腦膜和血管, 剪碎后經(jīng)0.125%胰蛋白酶37℃消化15 min,終止消化并吹打分散；100目濾網(wǎng)過濾后1000 r/min×10離心取沉淀, 用含2%B27的Neuronbasal培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液,以1×10-6ml密度接種在經(jīng)左旋多聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)板,于37℃、相對體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。以后每隔3 d以Neuronbasal/B27半量換液。采用免疫細(xì)胞化學(xué)NSE染色進(jìn)行神經(jīng)元的鑒定, 純度達(dá)到95%以上的可用于實驗。

1.2.2 建立體外可調(diào)控NF-κB的細(xì)胞模型：取培養(yǎng)滿意的神經(jīng)元細(xì)胞, 將每批細(xì)胞平均分成3組, 每組各重復(fù)3次實驗：①空白組：先加入2 μl PBS液1 h后, 再加入2 μl PBS液；②激活組：先加入2 μl PBS液1 h后, 加入2 μl濃度100 ng/ml的NF-κB激活劑PMA；③抑制組：先加入2 μl濃度25 mol/mL的NF-κB阻斷劑PDTC預(yù)處理1 h后再加入2 μl濃度100 ng/ml的PMA。各組細(xì)胞分別處理1、6、12、24、48 h。

1.2.3 神經(jīng)元細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)檢測：①應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)熒光法測定NF-κB蛋白的表達(dá)。一抗為兔抗鼠NF-κB多克隆抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜, 二抗為辣根過氧化物酶(1∶500) 標(biāo)記的山羊抗兔IgG,37 ℃孵育30 min。加入碘化丙啶(PI)標(biāo)記細(xì)胞核。②結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：高倍鏡下隨機(jī)觀察每組細(xì)胞5個以上有代表性視野(≥1000個細(xì)胞),用Leica激光共聚焦顯微鏡下照相, 并用Leica Confocal圖像分析軟件檢測核區(qū)熒光值, 每組計數(shù)陽性細(xì)胞(細(xì)胞漿呈綠色熒光)與細(xì)胞總數(shù)(所有細(xì)胞的細(xì)胞核呈紅色熒光)的比值計數(shù)。評分標(biāo)準(zhǔn)：0分, 沒有陽性細(xì)胞；1分, 陽性細(xì)胞百分比<10%；2分, 陽性細(xì)胞百分比≥10%但<30%；3分,陽性細(xì)胞百分比≥30%但<60%；4分, 陽性細(xì)胞百分比≥60%。在此基礎(chǔ)上通過染色或熒光強(qiáng)度按陰性、弱、中,強(qiáng)染色分別加成0～3分。

1.2.4 神經(jīng)元細(xì)胞自噬檢測 取各干預(yù)時間下的各組細(xì)胞提取蛋白, 使用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白提取物進(jìn)行蛋白定量, 調(diào)蛋白濃度一致, 按Towbin 等報道的蛋白印跡法進(jìn)行檢測自噬標(biāo)志性蛋白Beclin1。一抗為兔抗鼠Beclin1多克隆抗體(1∶1 000)37 ℃孵育1 h, 二抗為辣根過氧化物酶(1∶500)標(biāo)記的山羊抗兔IgG,37 ℃孵育1 h。以β-肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)對照, 用TBST進(jìn)行洗膜；化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行膜片的顯影。取檢測蛋白與內(nèi)參灰度值的比值作為Beclin1的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( χ-±s)表示, 采用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)情況 免疫細(xì)胞化學(xué)染色后, 鏡下含神經(jīng)元細(xì)胞特異抗原NSE的胞體和軸突為橙紅色, 標(biāo)記為陽性細(xì)胞。本實驗中培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度在95%以上。2.2 NF-κB蛋白的表達(dá)情況 實驗結(jié)果顯示, 在本實驗中, NF-κB蛋白的熒光表達(dá)主要在胞漿中, 部分在細(xì)胞核中, 在各組中的表達(dá)程度不同。激活組從6 h開始的NF-κB蛋白表達(dá)均高于抑制組和空白組的NF-κB表達(dá), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；激活組從1～24 h, NF-κB表達(dá)逐漸增加,24 h達(dá)到高峰,48 h稍下降。見圖1。抑制組從6～48 h時間點NF-κB蛋白表達(dá)均小于激活組高于空白組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

圖1 神經(jīng)元NF-κB表達(dá)免疫細(xì)胞熒光顯色(×200)

2.3 自噬情況 實驗結(jié)果顯示,1 h時間點內(nèi)激活組和抑制組分別與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).6、12、24、48 h各組兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Beclin1蛋白在激活組與抑制組中隨著時間的增加而表達(dá)增加, 激活組表達(dá)整體高于抑制組和空白組, 在24 h達(dá)到高峰, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表1 各組細(xì)胞不同時間點NF-κB蛋白熒光計分比較( χ-±s, 分)

表2 各不同時間點各組大鼠神經(jīng)元Beclin1表達(dá)情況( χ-±s, 位)

3 討論

Nonaka等實驗研究表明：腦損傷早期(1～2 h)NF-κB在軸突被激活,24 h～1周在神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)以及受傷皮質(zhì)的小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)被激活［3］。在體內(nèi), NF-κB的活化過程受到精細(xì)調(diào)控, 其中反饋調(diào)節(jié)是主要的調(diào)節(jié)方式。正反饋調(diào)節(jié)可通過細(xì)胞外機(jī)制進(jìn)行, 其作用是增強(qiáng)炎癥信號。腦創(chuàng)傷后NF-κB啟動了或調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄, 參與各種細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞死亡。自噬的雙面性在創(chuàng)傷性腦損傷中的研究意義重大, 一方面它本身可以誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞死亡和凋亡信號之間的交互作用；另一方面自噬可能在受損神經(jīng)細(xì)胞中幫助清除受損的細(xì)胞器, 防止細(xì)胞凋亡程序的啟動［4］。

在本實驗中, 實驗結(jié)果NF-κB蛋白表達(dá)在1 h時間點內(nèi)激活組與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 激活組從6 h開始的NF-κB蛋白表達(dá)均高于抑制組和空白組的NF-κB蛋白表達(dá), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。從而說明PMA能夠激活神經(jīng)元表達(dá)NF-κB蛋白, 激活組中從1～24 h時間點NF-κB蛋白表達(dá)逐漸增加,24 h達(dá)到高峰,48 h稍下降。在抑制組中NF-κB蛋白表達(dá)從12 h開始就高于空白組, 比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 說明PDTC能夠抑制NF-κB的表達(dá), 結(jié)合激活組的情況, 作者推斷NF-κB激活后炎性因子在早期(6 h)就開始表達(dá), 而PDTC能夠在早期就抑制NF-κB通路, 從而抑制了炎性因子對NF-κB通路的再刺激作用, 因此能夠減少NF-κB蛋白的表達(dá)量。而抑制組6～48 h時間點NF-κB蛋白表達(dá)均小于激活組高于空白組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), 也更有力地為作者的推斷提供了依據(jù)。激活組與抑制組在多個時間點內(nèi)NF-κB蛋白的表達(dá)均高于空白組, 也同時說明了PDTC不能完全抑制神經(jīng)元表達(dá)NF-κB蛋白。

應(yīng)用NF-κB激活劑PMA和NF-κB抑制劑PDTC不同時間點分別加入體外培養(yǎng)的神經(jīng)元中, 并分別與空白組比較Beclin1蛋白的表達(dá), 以此來觀察NF-κB信號通路是否參與自噬體形成過程。Beclin1蛋白是自噬的標(biāo)志性蛋白之一,它的表達(dá)表現(xiàn)了自噬在早期(1 h開始)就開始發(fā)生, 并隨時間的推移不斷增加, 在24 h時間點到達(dá)高峰, 之后穩(wěn)定于這一表達(dá)量水平。從實驗結(jié)果分析, 激活組中的Beclin1蛋白處于較高的表達(dá), 并隨著NF-κB表達(dá)量的增加而不斷增加,這也證明了NF-κB信號通路參與了自噬體形成的過程并起到促進(jìn)自噬的發(fā)生。

在抑制組中各個時間點的Beclin1蛋白表達(dá)均低于激活組, 這說明PDTC 能夠抑制NF-κB信號通路的作用, 機(jī)制可能是抑制了NF-κB信號通路激活后炎性因子的表達(dá)從而抑制自噬發(fā)生。抑制組中仍有較少量的Beclin1蛋白表達(dá),這也說明PDTC不能完全抑制NF-κB信號通路引起的自噬發(fā)生, 同時NF-κB通路是否通過其它機(jī)制參與自噬, 這仍需進(jìn)一步的實驗證明。

［1］ Jill Wong, Ng Wai Hoe, Feng Zhiwei, etal. Apoptosis and traumatic brain injury. Neurocritical Care,2005,3(2):177-182.

［2］ Petite CK, Chung MC, Verkhovsky IM, etal. Brain glutamine synthetase increase following cerebraI ischemia in the rat. Brain Res,1992.569(2):275-280.

［3］ Nonaka M, Chen XH, Pierce JE, etal. Prolonged activation of NF-kappaB following traumatic brain injury in rats. J Neurotrauma,1999,16(11):1023-1034.

［4］ Clark RS, Bayir H, Chu CT, etal. Autophagy is increased in mice after traumatic brain injury and is detectable in human brain after trauma and critical illness. Autophagy,2008,4(1):88-90.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.11.182

2015-03-19］

2013年廣東醫(yī)學(xué)院科研基金項目(項目編號：XK1456)

524001 廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科

陳兵