柚皮苷通過調控GSK-3β表達對糖尿病心肌病大鼠模型的心肌保護作用研究

黃瑞娜 吳鏗 游瓊 李騰 李上海 郭潤民 閆海

柚皮苷通過調控GSK-3β表達對糖尿病心肌病大鼠模型的心肌保護作用研究

黃瑞娜 吳鏗 游瓊 李騰 李上海 郭潤民 閆海

目的 明確柚皮苷是否通過調控糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)通路對抗糖尿病心肌病心肌損傷。方法 將60只大鼠隨機分為對照組、糖尿病心肌病組(DCM組)、柚皮苷組、 TDZD-8(GSK-3β抑制劑)組, 各15例。各組經處理后, 檢測血糖, 超聲心動圖檢測左心室功能參數, 免疫組織化學檢測心肌組織GSK-3β表達。結果 實驗第12周, 與柚皮苷組、TDZD-8組比較, DCM組血糖升高, 左心室舒張期末內徑(LVDD)、左心室收縮期末內徑(LVDS)增大, 左心室射血分數(LVEF)下降, 差異有統計學意義(P<0.05)。結論 柚皮苷在有效調節糖代謝的同時, 下調GSK-3β表達而心功能惡化。

糖尿病心肌病；柚皮苷；糖原合成酶激酶3β；心功能

目前有研究顯示, 抑制GSK-3β通路, 可有效改善大鼠糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)的癥狀［1］。近年來已有研究證實柚皮苷可有效防治糖尿病心肌病［2］。本實驗以鏈脲霉素誘導的 DCM 大鼠模型為對象, 研究柚皮苷是否通過調控GSK-3β通路保護DCM心肌細胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級Wister 大鼠, 雄性, 體重150～180 g (合格證號SCXK 粵2006-0015), 由南方醫科大學實驗動物中心提供。

1.1.2 主要藥物與試劑 Naringin粉沫(廣東省梅雁藍藻公司, 純度98%)；鏈脲佐菌素(美國SIGMA公司)；血糖試紙(強生“中國”醫療器材有限公司)；兔GSK-3βBeta多克隆抗體(上海恒斐生物科技有限公司)；TDZD-8(GSK-3β抑制劑) (上海甄準生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與處理 將60只Wister大鼠隨機分為以下四組：對照組、DCM組、柚皮苷組、TDZD-8組, 各15只。對照組予普通飼料喂養, 其余均高糖高脂飼養6周, 在第6周時,對照組同時采用檸檬酸緩沖液腹腔注射, 一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(ST.60 mg/kg, 臨用前用0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液溶解, pH =4.2)腹腔注射；注射72 h后, 如連續2次空腹血糖>11.1 mmol/L 視為糖尿病模型成功。隨后6周, 柚皮苷組每天予柚皮苷100 mg/(kg·次)灌胃1次, TDZD-8組每天靜脈注射1次TDZD-81 mg/(kg·次), 對照組及DCM組每天予生理鹽水灌胃1次。對照組繼續予普通飼料喂養, 其余均繼續高糖高脂飼養6周, 此時DCM模型成功。

1.2.2 左心室功能參數檢測 使用GE Vividi便攜式心臟彩超(探頭頻率為12 MHz)分別于動物造模前及實驗第12周分別行超聲心動圖檢查, 測量LVED、LVES、LVPWT及LVEF。每組數據均取連續3個心動周期的平均值。

1.2.3 心肌組織GSK-3β 免疫組織化學檢測石蠟切片經兔GSK-3βBeta多克隆抗體, DAB 顯色后, 采用Moti.6.0 數碼醫學圖像分析系統測定陽性光密度值。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示, 采用t檢驗；計數資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗各組大鼠空腹血糖的變化 一次性腹膜腔內注射小劑量鏈脲佐菌素72 h后, 柚皮苷組及TDZD-8組及DCM組血糖明顯升高, 血糖>11.1 mmol/L, 可認為糖尿病模型造模成功。實驗第12周, 柚皮苷組及TDZD-8組血糖降低,與DCM組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 超聲心動圖檢測結果 DCM組12周時LVDD、LVDS增大, LVEF下降, 與動物造模前及對照組比較差異有統計學意義(P<0.05), 提示糖尿病心肌病模型制備成功。柚皮苷組及TDZD-8組LVDD、LVDS、LVEF等與動物造模前及對照組差異無統計學意義(P>0.05), 與DCM組12周時結果比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 各組空腹血糖比較±s, mmol/L)

表1 各組空腹血糖比較±s, mmol/L)

注： 與對照組比較,aP<0.05；與DCM組比較,bP<0.05

組別例數0周STZ i.p.后72 h12周對照組154.93±0.865.29±0.655.21±0.71 DCM組155.03±0.7315.44±1.88a18.64±4.85a柚皮苷組154.81±0.8814.64±1.45a12.17±2.77abTDZD-8組155.08±0.7016.05±1.99a12.81±2.93ab

表2 各組超聲心動圖比較(n=15,±s, mm)

表2 各組超聲心動圖比較(n=15,±s, mm)

注：與對照組比較,aP<0.05,bP>0.05；與DCM組比較,cP<0.05

項目時間對照組DCM組柚皮苷組TDZD-8組LVPWT0周2.33±0.242.13±0.332.28±0.212.19±0.2312周2.21±0.212.43±0.252.17±0.172.21±0.23 LVDD0.5.33±1.215.21±1.245.18±1.535.29±1.2312周5.30±1.1.6.88±1.69a.5.21±1.12bc.5.26±1.22bcLVDS0周3.33±1.223.41±1.343.29±1.283.39±1.1312周3.21±1.194.86±1.39a3.27±1.37bc3.32±1.28bcLVEF0周 0.70±0.170.73±0.130.69±0.210.71±0.1512周0.70±0.19 0.47±0.23a0.67±0.27bc0.68±0.21bc

2.3 心肌細胞GSK-3β的表達 采用CMIAS系列 Motic. Med6.0數碼醫學圖象分析系統測量表示GSK-3β表達水平的陽性目標面光密度值, 柚皮苷組及TDZD-8組GSK-3β表達明顯低于DCM組, 差異具有統計學意義(P<0.05)；DCM組高于對照組(P<0.05)。由此表明, 柚皮苷及GSK-3β抑制劑能夠抑制GSK-3β表達。各組PKC的陽性目標面密度值的比較見表3。

表3 各組PKC的陽性目標面密度值的比較( χ-±s)

3 討論

糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase3β, GSK-3β)是真核細胞內一種多功能絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶, 參與糖原合成酶、電壓依賴性陰離子通道等50多種底物的活化［3］, 并參與調控糖代謝、 脂代謝、 細胞增殖和死亡等過程［4］。本研究中, DCM組較TDZD-8組血糖升高, 差異具有統計學意義(P<0.05), 心臟功能惡化。在大鼠DCM模型, 抑制GSK-3β通路, 可改善糖脂代謝和胰島素作用減輕糖脂毒性；從而改善DCM的癥狀［1,2］。所以, 有效調控GSK-3β的表達對糖尿病心肌病的心肌保護具有重大意義。

近年來研究證實糖尿病心肌病經柚皮苷干預后心肌肥厚、心肌損傷、心力衰竭減輕, 同時柚皮苷作用效應具有劑量依賴性［2,5］。本研究顯示柚皮苷及GSK-3β抑制劑在有效調節糖代謝的同時, 可改善心功能惡化, 而且兩者間效應差異無統計學意義(P>0.05)。另外柚皮苷組及TDZD-8組GSK-3β表達較DCM組明顯下降, 但兩者間比較差異無統計學意義(P>0.05)。因此作者認為柚皮苷通過有效調控GSK-3β表達而起到糖尿病心肌病心肌保護作用。

［1］ Yu W, Wu J, Cai F, etal. Curcumin alleviates diabetic cardiomyopathy in experimental diabetic rats. Plos One,2012.7(12):1411.

［2］ 游瓊, 吳鏗, 涂焰明, 等. 柚皮苷調控心肌核因子NF-κB 炎癥信號通路對糖尿病心肌病大鼠防治作用 . 中國免疫學雜志,2013,29(2):121-124.

［3］ Martel C, Allouche M, Esposti DD, etal. Glycogen synthase kinase3-mediated voltage-dependent anion channel phosphorylation controls outer mitochondrial membrane permeability during lipid accumulation. Hepatology,2013.57(1):93-102.

［4］ Takahashi-Yanaga F. Activator or inhibitor? GSK-3 as a new drug target. Biochemical pharmacology,2013.86(2):191-199.

［5］ 吳鏗, 黃瑞娜, 游瓊, 等. 柚皮苷對糖尿病心肌病大鼠心肌的保護作用. 國際心血管病雜志,2012,39(5):302-305.

Research of protective effect by naringin for myocardium in diabetic cardiomyopathy rats by regulating expression of GSK-3β

HUANG Rui-na, WU Keng, YOU Qiong, etal.
Department of Cardiovascular Medicine, Affiliated Hospital of Guangdong Meidcal College, Zhanjian.524001, China

Objective To explore the approach of naringin in prevention of myocardial damage in diabetic cardiomyopathy by regulating expression of Glycogen synthase kinase3β (GSK-3β). Methods A total o.60 rats were randomly divided into control group, diabetic cardiomyopathy group (DCM group), naringin group, and TDZD-8 (GSK-3β inhibitor) group, and each group contained15 cases. Detections were made on blood glucose, left ventricular function parameters by ultrasonic cardiogram, GSK-3β expression in myocardial tissue by immunohistochemical method. Results In the12 weeks of experiment, DCM group had increased blood glucose, left ventricular diastolic diameter (LVDD), left ventricular diameter systolic (LVDS), and decreased left ventricular ejection fraction (LVEF) then the naringin group and TDZD-8 group. Their differences hadstatistical significance (P<0.05). Conclusion Naringin can effective regulate glycometabolism, along with reduce expression of GSK-3β for reduced cardiac function.

Diabetic cardiomyopathy; Naringin; Glycogen synthase kinase3β; Cardiac function

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.11.181

2015-03-20］

524001 廣東醫學院附屬醫院心血管內科

吳鏗