骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)老年大鼠受壓組織炎癥性損傷的影響

王艷 張穗 陳慧敏 刁波 熊毅敏 高金華

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)老年大鼠受壓組織炎癥性損傷的影響

王艷 張穗 陳慧敏 刁波 熊毅敏 高金華

目的 研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）對(duì)老年大鼠受壓組織炎癥性損傷的影響，以期為BMMSCs用于老年壓瘡的臨床治療提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 將40只SPF級(jí)雄性老年SD大鼠（喂養(yǎng)16月）隨機(jī)分成正常組、模型組、BMMSCs移植組和生理鹽水組。倒置顯微鏡下觀察雄性Wistar大鼠的BMMSCs形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMMSCs表面標(biāo)記物CD105、CD45、CD44、CD29的表達(dá)；生化檢測(cè)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子?1（SDF?1）及白細(xì)胞介素?6（IL?6）的表達(dá)。肉眼觀察BMMSCs干預(yù)后壓瘡瘡面的愈合情況。 結(jié)果 分離所得細(xì)胞能在體外傳代培養(yǎng)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞陽性表達(dá)CD44、CD29，陰性表達(dá)CD105、CD45；生化實(shí)驗(yàn)提示：與正常組比較，模型組中SDF?1和IL?6表達(dá)量顯著上升，BMMSC移植組中SDF?1和IL?6表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。BMMSCs移植組壓瘡瘡面愈合遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于生理鹽水組（P＜0.01）。 結(jié)論 BMMSCs在SDF?1趨化作用下遷移歸巢到受壓損傷的組織，通過抑制細(xì)胞炎癥因子IL?6的釋放，降低損傷組織的炎癥反應(yīng)，在老年大鼠壓瘡瘡面修復(fù)愈合中起著重要作用。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；壓瘡；老年人；傷口愈合；動(dòng)物模型

壓瘡是嚴(yán)重威脅老年臥床患者生活質(zhì)量及生命的重要疾病，隨著世界老齡化的到來，老年壓瘡的發(fā)生機(jī)制及防治研究已成為全球普遍關(guān)注的問題。近年研究表明，炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的過度釋放嚴(yán)重影響老年壓瘡瘡面的愈合［1］。而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）可在適宜條件下，被誘導(dǎo)分化為骨、肌腱、肌肉等多種中胚層來源的組織細(xì)胞［2］，通過其抗炎，增加趨化因子等作用，成為替代、修復(fù)或加強(qiáng)受損組織或器官功能的理想種子細(xì)胞。為此，本研究將BMMSCs移植于老年壓瘡大鼠模型皮膚瘡面，觀察它對(duì)老年壓瘡大鼠炎癥性損傷的治療效果及瘡面愈合的影響，為將BMMSCs應(yīng)用于臨床老年壓瘡修復(fù)進(jìn)行移植提供線索和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性老年SD大鼠（喂養(yǎng)16月）40只，體質(zhì)量330～620 g，平均（503±82.5）g。購(gòu)自湖北實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（鄂）2008－0004。

1.1.2 試劑：F12細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）購(gòu)自美國(guó)Hy?clone；胎牛血清及0.25%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco；PVDF膜，顯影膠片，Percoll分離液（比重1.073）購(gòu)自碧云天公司，熒光標(biāo)記小鼠抗大鼠單克隆抗體CD29、CD44、CD45及CD105購(gòu)自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 BMMSCs的體外分離及原代培養(yǎng)：斷頸處死Wistar大鼠，超凈臺(tái)上從髂骨或胸骨抽取供者骨髓，用肝素抗凝，搖勻，用D?Hanks液或生理鹽水稀釋骨髓1～2倍；取Ficoll?Hypaque（有成品供應(yīng)，相對(duì)密度為1.077 ±0.001），放入離心管；混勻稀釋后的骨髓液，沿試管壁緩緩加入，使稀釋血液重疊于分層液上，稀釋的血液與分離液體積比例約為2∶1；用水平離心機(jī)以900 r／min（室溫）離心30 min，離心后管內(nèi)容物分為3層，上層為血漿（內(nèi)含血小板），中間層為分層液，底層為紅細(xì)胞和多核細(xì)胞。在上、中層液體界面處可見到乳白色混濁的單個(gè)核細(xì)胞層，呈白膜狀；用毛細(xì)吸管輕輕插到白膜層，沿試管壁周緣吸取界面層單個(gè)核細(xì)胞，移入另一試管中；加入5倍以上體積D?Hanks液，混勻，1200 r／min離心10 min，吸棄上清液，重復(fù)洗滌2次；末次離心后，吸盡上清。用于干細(xì)胞元代培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。原代培養(yǎng)24 h后，半量換液，去除未貼壁的造血細(xì)胞；每3～4 d換液1次；7～10 d后待細(xì)胞生長(zhǎng)接近80%～90%后，用0.25%胰酶（含0.01%EDTA）消化，消化時(shí)間≤2 min。

1.2.2 BMMSCs的鑒定：取擴(kuò)增一代的間充質(zhì)干細(xì)胞，去掉培養(yǎng)液，PBS洗2遍，用1∶1的0.25%的胰蛋白酶和0.2%EDTA混合液消化，用含20%BSA的PBS洗滌后制成濃度為1.0×106／ml的單細(xì)胞懸液，每個(gè)Eppendof管加500 μl細(xì)胞懸液，共3個(gè)檢測(cè)管。1號(hào)管為陰性對(duì)照（不加抗體），2號(hào)管為同型對(duì)照（分別加入5 μl抗鼠的IgG1?FITC、APC、PE、PerCP／Cy5.5），3號(hào)管為檢測(cè)管（分別加入5 μl抗人的CD105?PerCP／ Cy5.5、CD45?APC、CD44?FITC、CD29?PE）。室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3 老年大鼠壓瘡模型制作：40只老年大鼠均禁食12 h，用10%水合氯醛按300 mg／kg腹腔注射麻醉后，其中30只用6%的硫化鈉溶液輕柔脫除以左側(cè)大轉(zhuǎn)子為中心直徑5 cm范圍的被毛，將大鼠仰臥于設(shè)計(jì)好的簡(jiǎn)易加壓裝置上，該裝置由固定和加壓兩部分組成。大鼠的四肢用膠布固定于底盤上，加壓部分通過倒立的鐵釘來完成。用游離卡尺測(cè)量大鐵釘釘帽的直徑為0.64 cm、0.62 cm、0.59 cm、0.60 cm、0.58 cm、0.63 cm、0.60 cm、0.61 cm，測(cè)8個(gè)大鐵釘釘帽直徑后取平均值為0.60 cm。同時(shí)將造模時(shí)施加在老年SD大鼠身上的壓力設(shè)為46 kPa，施壓時(shí)間12 h［3］。以皮膚破潰，可見滲液，呈不規(guī)則的凹坑作為判斷壓瘡潰瘍期的標(biāo)準(zhǔn)［4］。期間每只大鼠單籠飼養(yǎng)，自由飲水與進(jìn)食，切口噴灑抗生素溶液預(yù)防感染。另外10只作為正常組不進(jìn)行造模，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后直接頸動(dòng)脈取血后實(shí)施安樂死。

1.2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及處理：將30只造模成功老年大鼠隨機(jī)分成3組：模型組、生理鹽水組及BMMSCs移植組，另外10只作為正常組，各組間大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。分籠喂養(yǎng)，房間溫度保持在22℃～24℃，濕度保持在50%～70%，明暗周期為12 h，自由飲水和進(jìn)食。生理鹽水組及BMMSCs移植組大鼠瘡面先用1%碘伏清創(chuàng)，再以無菌生理鹽水棉球擦洗創(chuàng)面。BMMSCs移植組用1 ml注射器給其尾靜脈注射第4代生長(zhǎng)良好的、細(xì)胞濃度為2×105／ml的BMMSCs。生理鹽水組用1 ml注射器給其尾靜脈注射生理鹽水。正常組模型組不予任何處理。2周后直接頸動(dòng)脈取血后實(shí)施安樂死。

1.2.5 壓瘡瘡面肉眼觀察及生化指標(biāo)檢查：包括瘡面收縮大小及潛行程度、局部炎癥、肉芽組織及上皮愈合情況。各組大鼠安樂死后，均切取瘡面及周圍0.5 cm的正常全層皮膚及部分肌層組織（正常組位置與其余3組同），4℃冰鹽水洗凈，濾紙吸干置于－70℃保存。另取相同部位的肌肉組織，4℃冰鹽水中快速洗去血液，10%甲醛液固定、脫水、石蠟包埋、切片、行HE染色及TUNEL熒光標(biāo)記。凍存的樣品同一天同一批按組織質(zhì)量（g）／生理鹽水毫升數(shù)（ml）＝1∶9配備成10%肌肉勻漿，4℃環(huán)境下以3500 r／min離心10 min，仔細(xì)收集上清液保存待測(cè)。嚴(yán)格按照各試劑盒提供的說明書檢測(cè)大鼠肌肉組織中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子?1（stromal cell derivedfactor?1，SDF?1）和白細(xì)胞介素?6（interleukin?6，IL?6）的表達(dá)。

1.2.6 潰瘍愈合率的觀察：壓瘡成模當(dāng)天及BMMSCs移植及生理鹽水注射后第5天、第10天、第14天用康樂寶傷口尺測(cè)量并記錄2組瘡面愈合面積（原始瘡面面積－剩余未愈合的面積），計(jì)算瘡面愈合率（瘡面愈合率＝瘡面愈合面積／原瘡面面積×100%）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)資料用ˉx±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法（方差齊時(shí)）和Tamhane's T2法（方差不齊時(shí)），組間愈合率比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMMSCs形態(tài)學(xué)觀察 原代培養(yǎng)：初種的細(xì)胞呈圓球狀分散懸浮于培養(yǎng)液中。24 h即可見有貼壁的間充質(zhì)樣細(xì)胞，并有集落形成。同時(shí)有大量的破骨樣細(xì)胞混雜，72 h換液去除非黏附細(xì)胞后，留下來的細(xì)胞大多貼壁生長(zhǎng)。貼壁的細(xì)胞呈單層片狀分布，或以集落性放射狀生長(zhǎng)，形態(tài)較均一，呈飽滿的梭形、紡錘形單個(gè)核，兩端有細(xì)長(zhǎng)突起，折光性強(qiáng)，增生旺盛，同時(shí)有大量的破骨樣細(xì)胞混雜。原代培養(yǎng)7～10 d的細(xì)胞相互融合至80%～90%即可消化傳代，以含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的LG?DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。傳至第4代時(shí)，大部分細(xì)胞（包括破骨樣細(xì)胞）逐漸被去除，剩下形態(tài)較為單一的成纖維樣細(xì)胞，見圖1。

2.2 大鼠BMMSCs的流式細(xì)胞儀檢測(cè) 結(jié)果顯示，第4代細(xì)胞均一性較好，達(dá)99%以上，造血干細(xì)胞的表面標(biāo)記CD45和CD105表達(dá)呈陰性，而CD29和CD44表達(dá)呈陽性，陽性率為88.62%。說明傳代貼壁生長(zhǎng)的梭形細(xì)胞為BMMSCs。見圖2。

圖1 分離培養(yǎng)的BMMSCs

2.3 瘡面肉眼觀察及愈合率比較 BMMSCs組大鼠壓瘡瘡面滲出液減少，肉芽組織生長(zhǎng)迅速，色澤鮮艷，呈淡紅色，瘡面干燥，傷后第5天創(chuàng)面已明顯收縮。第14天已基本愈合。生理鹽水組壓瘡瘡面愈合緩慢，肉芽生長(zhǎng)相對(duì)遲緩，色澤稍暗，傷后第10天僅愈合近半，第14天仍有較大部分瘡面未痊愈。2組愈合率比較見表1。

圖2 BMMSCs流式鑒定圖

表1 BMMSCs及生理鹽水組潰瘍瘡面動(dòng)態(tài)愈合率比較（xˉ±s，%，n＝10）

2.4 各組IL?6、SDF?1含量的變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組中IL?6和SDF?1表達(dá)水平顯著上升（P＜0.01）。與模型組比較，BMMSCs移植組中IL?6和SDF?1表達(dá)水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而生理鹽水組中IL?6表達(dá)水平增高（P＜0.01），SDF?1表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表2。

3 討論

近期研究顯示［5］：老年壓瘡的發(fā)生是多因素共同參與的復(fù)雜病理生理過程，包括氧化應(yīng)激反應(yīng)，炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等。其中炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的過度釋放及其相互作用在老年壓瘡發(fā)生發(fā)展、壓瘡瘡面愈合中起重要作用。

表2 各組IL?6、SDF?1含量的變化（ˉx±s，n＝10）

SDF?1屬于CXC趨化因子家族成員，由骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，低氧誘導(dǎo)表達(dá)［7］。當(dāng)局部皮膚持續(xù)受壓導(dǎo)致缺血缺氧狀況后，損傷部位SDF?1的分泌迅速增加。SDF?1具有強(qiáng)烈的趨化作用，介導(dǎo)炎癥細(xì)胞集聚、黏附、穿過內(nèi)皮細(xì)胞跨膜遷移、到達(dá)病灶，促使受損組織發(fā)生局部炎癥反應(yīng)。炎癥區(qū)域產(chǎn)生的趨化因子對(duì)浸潤(rùn)性細(xì)胞的遷移及活化是引起組織病理損傷的基礎(chǔ)。IL?6是炎癥反應(yīng)的主要標(biāo)志之一［1］，除對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及炎性細(xì)胞具有直接的激活和毒性作用外，更主要的是誘導(dǎo)急性期蛋白的合成，催化和放大炎性反應(yīng)。同時(shí)在炎癥條件下IL?6等多種遞質(zhì)，反過來又可促使炎癥細(xì)胞大量分泌SDF?1，形成復(fù)雜的炎癥介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，激發(fā)細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生或“瀑布效應(yīng)”，加劇組織炎癥損傷過程［8］。

我們從老年大鼠髂骨抽取供者骨髓，分離BMMSCs并在體外進(jìn)行增殖培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀鑒定發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞表面分子CD29、CD44表達(dá)陽性，CD45、CD105表達(dá)陰性，提示本研究采用密度梯度離心法獲得較純化的BMMSCs。作為一種來源于中胚層的成體干細(xì)胞，BMMSCs具有向損傷組織、缺血區(qū)域定向遷移的能力，稱之為“歸巢”（homing），這種“歸巢”特性使得組織受損時(shí)，骨髓會(huì)迅速動(dòng)員多種干細(xì)胞遷移至病變處，產(chǎn)生自然的代償性修復(fù)；而外源性間充質(zhì)干細(xì)胞也會(huì)歸巢在損傷靶器官中，發(fā)揮生物學(xué)作用，它是體內(nèi)干細(xì)胞修復(fù)損傷或替代壞死結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)［10］。本實(shí)驗(yàn)顯示：BMMSCs移植組大鼠壓瘡瘡面滲出液減少，肉芽組織生長(zhǎng)迅速，色澤鮮艷，呈淡紅色，瘡面干燥，第14天全部愈合。生理鹽水組瘡面愈合緩慢，肉芽生長(zhǎng)相對(duì)遲緩，色澤稍暗，傷后第14天瘡面大部分仍未痊愈。結(jié)合生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，原因可能為SDF?1既是調(diào)節(jié)局部炎癥的重要趨化因子，也對(duì)BMMSCs歸巢具有介導(dǎo)促進(jìn)作用［10?11］，它所介導(dǎo)的BMMSCs遷移歸巢到受壓損傷的組織后，可能通過某些途徑誘導(dǎo)輔助性T淋巴細(xì)胞TH1向TH2細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制細(xì)胞炎癥因子IL?6的釋放，阻止炎癥相關(guān)細(xì)胞如中性粒細(xì)胞的聚集、激活，降低損傷組織的炎癥反應(yīng)，啟動(dòng)受損組織修復(fù)。同時(shí)BMMSCs因本身強(qiáng)大的可塑性分化為皮膚組織的各種細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞、皮膚附屬器細(xì)胞等共同參與瘡面修復(fù)，不僅促進(jìn)老年壓瘡愈合速度，而且還可提高老年壓瘡的愈合質(zhì)量。

綜上所述，BMMSCs在SDF?1趨化作用下可遷移歸巢到受壓損傷的組織，通過抑制細(xì)胞炎癥因子IL?6的釋放，降低損傷組織的炎癥反應(yīng)，在老年大鼠壓瘡瘡面修復(fù)愈合中起著重要作用，因而可作為候選的種子細(xì)胞用于老年壓瘡的治療。然而，有關(guān)BMMSCs如何發(fā)揮作用，是否對(duì)老年壓瘡各個(gè)發(fā)病階段都發(fā)揮作用、以及植入后在體內(nèi)的最終命運(yùn)等等問題，還需要研究人員進(jìn)一步深入探討。

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Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on inflammatory injury in aged rats tissue under pressure

WANG Yan，CHEN Hui?min，XIONG Yi?min，GAO Jin?hua．
Department of Digestive Diseases；ZHANG Sui．Department of Opera?tion；DIAO Bo．Department of Neurosurgery Experimental Center，Wuhan General Hospital of Guangzhou Command，PLA，Wuhan 430070，China．

Objective To study the effect of bone marrow mesenchymal stem cells（BMMSCs）on inflammatory injury in tissues of aged rats under pressure and to provide a new source of seeding cells for clinical uses. Methods Forty SPF?graded male SD rats，which were fed for 16 months，were randomly divided into normal group，model group，BMMSCs trans?plantation group and saline group.The morphological changes of BMMSCs of male Wistar rats were observed under the invert?ed microscope；The expression of surface markers?CD105，CD45，CD44 and CD29 of BMMSCs were detected by flow cytome?try.The levels of interleukin?6（IL?6）and stromal cell derived factor?1（SDF?1）were also measured.And the healing rate of the pressure ulcer after intervention were observed. Results The isolated cells were able to be cultured in vitro；the expres?sions of CD44 and CD29 were positive while the expression of CD105 and CD45 were negative；The concentration of SDF?1 and IL?6 of the rats in the model group were significantly higher than those in the normal group（P＜0.01）while those in the BMMSCs transplantation group were significantly lower than those in the model group（P＜0.01）.The healing rate of the BMMSCs transplantation group was much higher than that of the saline group. Conclusions BMMSCs is able to move to in?juried tissues by the chemotaxis of SDF?1，and reduce the inflammatory response in injuried tissues by inhibiting the release of IL?6，therefore，BMMSCs plays an important role in healing of pressure ulcers in the aged rats.

bone marrow mesenchymal stem cells；pressure ulcers；aged；wound healing；animal model

R 632.1

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2015.04.008

2014?06?17）

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2012FFB06806）；湖北省衛(wèi)生廳2013?2014年度科研項(xiàng)目（HL2012?8）

430070湖北省武漢市，中國(guó)人民解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院消化內(nèi)科（王艷，陳慧敏，熊毅敏，高金華），手術(shù)室（張穗），神經(jīng)外科醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心（刁波）