乙肝病毒全S蛋白反式激活蛋白1在膀胱癌組織中的表達分析

林麗華 ，吳秀珍 ，黃紹娥 ，卓德祥 ，涂文瑞

(1、福建醫科大學附屬三明第一醫院檢驗科，福建三明365000；2、三明市中西醫結合醫院檢驗科，福建三明365000)

膀胱癌有非浸潤性膀胱癌和浸潤性膀胱癌兩種類型。這兩種類型的膀胱癌有著不同的分子改變，并且臨床預后也不相同[1]。前者發病率較高，約占膀胱癌患者總數的70%，對生命威脅較小，但卻因易復發需要定期復查，對患者造成巨大的經濟負擔；浸潤性膀胱癌發病率較低，占臨床上膀胱癌總數的30%，但其往往更容易發生遠處轉移而導致不良的臨床后果[2]。為深入研究膀胱癌在分子水平的改變，我們用基因芯片分析兩種類型膀胱癌的基因表達譜，結果顯示乙肝病毒全S蛋白反式激活蛋白 1(complete S transactivated protein 1，CSTP1)[3]在膀胱癌組織表達較癌旁組織明顯降低,信息學分析顯示CSTP1 mRNA編碼一個分子量36kDa的蛋白磷酸酶催化亞單位結構域(protein phosphatase 2A catalytic unit，PP2Ac)。 為進一步驗證基因芯片結果，我們用RT-PCR及免疫組化方法檢測CSTP1基因mRNA及蛋白在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達差異，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 RT-PCR 提取膀胱癌及癌旁組織總RNA，反轉錄合成cDNA第1鏈，上下游引物：5'-ACA TCC ACT CAA ACG CTC ACC-3'和5'-ACA CAT GGG GAT TAT GGG GAT-3'，擴增 CSTP1 基因(140bp)。

1.2 抗體制備 合成IDEDDDYYFNLSKSTRKKLA多肽抗原，將多肽抗原與完全弗氏佐劑充分混合乳化后進行首次皮下、皮內多點注射。將不完全弗氏佐劑與抗原混合，于第14、24、35d進行加強免疫。末次加強免疫后6d耳緣靜脈取血進行抗體特異性測定。末次取血后5d心臟取血，分離血清并親和層析純化。

1.3 質粒構建 RT-PCR法擴增CSTP1基因ORF全長(引物 1：5'-AA GGA TCC AAC TCG CTC GCC ATG TCG-3'; 引物 2：5'-AA GAA TTC CTT TTT TCT TGA TCA AAT CCA TGA GAT C-3'),克隆入pGEM-T-easy質粒，雙向測序正確后亞克隆入pcDNA3.1myc/his C質粒，所得質粒命名為pcDNA3.1myc/his C-CSTP1。

1.4 蛋白免疫印跡 pcDNA3.1myc/his C-CSTP1質粒轉染人胚腎293T細胞，48h后，提取細胞總蛋白，Bradford法蛋白定量。80V電壓電泳，200mA恒流轉膜1.5h,脫脂牛奶室溫封閉1h，加1:2000稀釋的兔抗CSTP1多克隆抗體，4℃孵育過夜，第2天，TBST洗滌3次，加二抗。TBST洗3次后顯色、曝光。

1.5 免疫組化染色 甲醛固定后石蠟組織切片經二甲苯脫蠟、分級酒精水化后，3%過氧化氫室溫封閉內源性過氧化酶活性15min，在10mmol/L EDTA(pH 8.0)中高壓熱修復3min，兔抗CSTP1抗體(1:200)4℃孵育過夜,EnVision兩步法系統檢測CSTP1的表達。

2 結果

2.1 CSTP1 mRNA在膀胱癌組織中表達明顯下調我們用RT-PCR方法檢測CSTP1 mRNA在膀胱癌組織及癌旁組織中的表達，RT-PCR結果顯示，CSTP1 mRNA在膀胱癌組織表達較來源于同一病人的癌旁組織明顯降低。見圖1。

圖1 CSTP1 mRNA在膀胱癌組織中表達明顯降低

2.2 多克隆抗體制備及鑒定 DNA star軟件分析CSTP1的蛋白氨基酸序列顯示，CSTP1蛋白第213氨基酸至第232氨基酸之間的多肽(IDEDDDYYFNLSKSTRKKLA)具有良好的抗原性、疏水性并可能位于蛋白表面，適合于作為制備多克隆抗體的免疫原。我們將此多肽合成并與KLH連接后形成所需抗原，與完全弗氏佐劑充分混合乳化后進行皮下、皮內多點注射新西蘭大白兔，將不完全弗氏佐劑與抗原混合，充分乳化后于第14、24、35d進行加強免疫。末次加強免疫后6d耳緣靜脈取血進行抗體特異性檢測。末次取血后5d心臟取血，分離抗血清并親和層析純化。為檢測制備的多克隆抗體的特異性，我們把pcDNA3.1myc/his CCSTP1及對照空質粒轉染293T細胞，提取細胞總蛋白，Western Blot檢測CSTP1蛋白的表達。Western結果顯示，轉染了pcDNA3.1myc/his CCSTP1質粒組細胞在36kDa分子量處有一特異信號帶，該結果驗證了制備的多克隆抗體具有良好的特異性。見圖2。

圖2 293T細胞中CSTP1蛋白表達

2.3 免疫組化分析CSTP1蛋白在膀胱癌組織中的表達 基因的表達調控具多水平性，mRNA表達減少并不一定代表執行功能的蛋白質的表達降低，我們用制備的多克隆抗體檢測CSTP1蛋白在膀胱癌組織中的表達，免疫組化結果顯示，CSTP1蛋白產物在非浸潤性膀胱癌及浸潤性膀胱中表達均較癌旁組織明顯降低。見圖3。

圖3 CSTP1蛋白在膀胱癌組織中的表達

3 討論

蛋白磷酸酶催化已經磷酸化蛋白質發生去磷酸化，并進而調節蛋白分子的生物活性，其與蛋白激酶相對應存在，共同調節磷酸化和去磷酸化這一重要的蛋白質翻譯后修飾機制。目前研究人員至少已經發現500多種蛋白激酶，如Akt[4-6]、Ras[7，8]、BRAF[9,10]、PIM-1[11,12]等 ， 并 且 對 蛋 白 激 酶 的 功能，尤其在人類腫瘤發生發展過程中的作用進行了深入的研究，但對于去磷酸化的磷酸酶，研究人員的認識不論從種類還是其功能都很膚淺。有研究顯示,在人類腫瘤中蛋白磷酸酶往往具有抑制腫瘤發生發展的特性,如PTEN[13,14],PP2A[15]等。我們前期基因芯片結果顯示CSTP1在膀胱癌組織表達較癌旁組織明顯降低,信息學分析顯示CSTP1 mRNA編碼一個分子量36kDa的PP2Ac。

然而，基因芯片雖然具有高通量的優點，卻存在著假陽性的缺點。為了驗證基因芯片結果的可靠性，我們用RT-PCR及免疫組化方法檢測CSTP1基因mRNA及蛋白在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達，結果顯示，膀胱癌組織CSTP1基因在mRNA及蛋白質水平表達均較癌旁組織明顯降低，提示CSTP1可能是一個抑癌基因，其低表達可能參與了膀胱癌的發生發展過程。

在本研究中，我們用RT-PCR和免疫組化方法檢測了CSTP1在膀胱癌組織中的表達，成功制備了兔抗CSTP1多克隆抗體，為進一步研究CSTP1對膀胱癌細胞的增殖、周期、凋亡的影響及其分子機制鋪墊了基礎。

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