急性髓系白血病患者循環(huán)micro RNA-335的檢測(cè)及其臨床意義

黃淑英，魯勇，劉靜

(1、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南昌330006；2、新建縣人民醫(yī)院，江西 新建 330100)

急性髓系白血病 (acute myeloid leukemia,AML)是一種以骨髓中異常的原始細(xì)胞和幼稚細(xì)胞大量增殖并抑制正常造血為特征的高度異質(zhì)性的惡性血液病[1]，其死亡率在全國各年齡段惡性腫瘤死亡率中名列前茅，居兒童和35歲以下成人惡性腫瘤死亡率的榜首[2]。臨床上，AML的早期正確診斷對(duì)疾病的治療、預(yù)后、療效觀察均有十分重要的意義，目前除了國際上統(tǒng)一的急性白血病傳統(tǒng)的FAB形態(tài)學(xué)分型和MICM(Morphology,lmmunology,Cytogenetics,Molecular biology)分型外，尋找新的無創(chuàng)診斷與分型的生物學(xué)標(biāo)志物也是當(dāng)今研究者所關(guān)注的焦點(diǎn)[3]。

microRNA是新近發(fā)現(xiàn)的一類在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的小分子RNA，研究表明它與急性白血病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且在不同的類型中呈特征性表達(dá)，因此在白血病的診斷治療方面有極大的潛力[4,5]。最近研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-335在不同腫瘤中分別發(fā)揮著抑癌基因和促癌基因的作用，參與多條癌性信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[6]，在AML患者骨髓原始細(xì)胞中高表達(dá)[7]。但其在AML患者外周血中的表達(dá)情況及其臨床意義尚無相關(guān)研究提及，本研究擬通過RT-PCR對(duì)AML患者循環(huán)miRNA-335的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定并探討其在AML中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 基本資料 本研究收集2010年1月-2012年12月南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院初診未治療AML患者。所有病例均按照張之南、沈悌主編《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》第3版急性髓系白血病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，聯(lián)合基因、免疫表型、生物學(xué)、臨床特點(diǎn)對(duì)疾病進(jìn)行診斷。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。所有病例均在入院未采取任何治療時(shí)采集EDTA抗凝外周血2ml，離心分離血漿-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)，ABI7500熒光定量PCR擴(kuò)增儀(美國 Applied Biosystems公司)，PCR擴(kuò)增儀 (德國Biometra 公司)，Trizol(美國 Invitrogen 公司)，紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)。

1.3 總RNA的抽提 取1ml TRIZOL標(biāo)本，加入200μl氯仿， 離心 12000g，15min； 取無色水相層500μl至新的EP管，加500μl異丙醇，冰上靜置30min 后離心 12000g，15min；棄上清，與 1ml 75%乙醇混勻離心12000g，5min；再次棄上清，與1ml無水乙醇混勻離心12000g，5min；棄上清，干燥3~5min后用適量DEPC水溶解；檢測(cè)RNAOD260/OD280比值及濃度，存-80℃?zhèn)溆谩Ｋ胁僮骶诒线M(jìn)行，離心機(jī)設(shè)置溫度4℃。

1.4 microRNA檢測(cè) 合格RNA樣本使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進(jìn)行qRTPCR。 miRNA-335 上游引物：5’-GCG GTC AAG AGC AAT AAC GAA-3’，下游引物：5’-GTG CAG GGT CCG AGG TAT TC-3’；內(nèi)參U6上游引物：5’-CTC GCT TCG GCA GCA-3’； 下游引物：5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’。

使用Takara SYBR Green II qRT-PCR試劑盒及ABI7500 PCR儀同時(shí)檢測(cè)miRNA-335及U6，以 20μl體系擴(kuò)增：2μl cDNA，Takara SYBR Premix Ex TaqTM II(2×)10.0μl，上下游引物各 1.0μl，ROX Reference DyeII(50×)0.4μl，5.6μl ddH2O。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性 1min；95℃變性 5 sec，60℃退火 30 sec，共40個(gè)循環(huán)。qRT-PCR每次測(cè)定均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以U6表達(dá)量為內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)雙delta法計(jì)算miRNA-335的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式為：(1)相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt；(2)ΔΔCt= (CtmiRNA-CtU6)MDS-(CtmiRNA-CtU6)control。目的miRNA的表達(dá)量以相對(duì)循環(huán)閾值(CT)進(jìn)行評(píng)估，最終組間采用U6表達(dá)量校正后數(shù)值進(jìn)行比較。本研究結(jié)果均以基因表達(dá)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 本研究采用SPSS 12.0軟件行輔助分析。所有數(shù)據(jù)使用前均需要進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。三組及以上資料比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較則采用LSD-t行方差齊性檢驗(yàn)。如果資料對(duì)應(yīng)總體方差不齊，可使用多個(gè)獨(dú)立樣本比較的Kruskall-Wallis H檢驗(yàn)(三組及以上)或者M(jìn)ann-Whitney U檢驗(yàn)(兩組)進(jìn)行比較分析。P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

繪制miRNA-335表達(dá)量診斷AML的ROC曲線并計(jì)算曲線下面積AUC。AUC取值范圍為0.5~1，一般認(rèn)為AUC在0.5~0.7之間診斷價(jià)值較低，在0.7~0.9之間診斷價(jià)值中等，0.9以上認(rèn)為診斷價(jià)值較高。

2 結(jié)果

2.1 納入研究的病例特征 2010年1月至2012年12月收治急性髓系白血病患者共26例，男16例，女10例，年齡22~65歲，中位年齡38歲。外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù) 1.6~263.9×109/L， 平均 13.6×109/L，稍高于正常值；外周血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)0.7~4.3×1012/L，平均2.6×1012/L，均出現(xiàn)程度不同的下降；外周血血小板計(jì)數(shù) 10.0~181.0×109/L， 平均 32.0×109/L，較正常水平顯著降低；外周血淋巴細(xì)胞百分比5.0%~46.3%，平均15.0%，比例偏低；外周血原始細(xì)胞計(jì)數(shù)10.0%~95.0%，平均65.0%，骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)15.0%~94.5%，平均72.0%，均出現(xiàn)明顯異常。納入對(duì)照組為26例健康體檢者，男、女各13例，年齡21~63歲，中位年齡34歲，均未曾被診斷為惡性或者其他良性疾病。其中包括FAB分型M1，M2，M3，M4，M5，見表 1。

表1 26例AML病例FAB分型

2.2 miRNA-335在AML患者與健康對(duì)照組的表達(dá)量比較 miRNA檢測(cè)結(jié)果顯示如圖 1，26例AML患者miRNA-335表達(dá)量為3.70±1.21，健康對(duì)照組的miRNA-335表達(dá)量為1.78±0.35，兩組間方差不齊，Mann-Whitney U檢驗(yàn)結(jié)果概率P<0.001，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 AML患者與健康對(duì)照者miRNA-335表達(dá)量比較

2.3 miRNA-335在AML疾病中的臨床意義 統(tǒng)計(jì)分析循環(huán)miRNA-335相對(duì)表達(dá)量在同組內(nèi)納入研究對(duì)象的年齡、性別比較上未見明顯差異 (P>0.05)。與AML患者外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)及原始細(xì)胞計(jì)數(shù)無顯著相關(guān)性(P>0.05)。與骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)及FAB分型無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

但我們繪制miRNA-335表達(dá)量診斷AML的ROC曲線并計(jì)算曲線下面積AUC后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以相對(duì)表達(dá)量 2.7為 cutoff值時(shí)，miRNA-335診斷AML的 AUC可達(dá)0.915(95%可信區(qū)間：0.828~1.000；P<0.0001)，miRNA-335 診斷 AML 的敏感性可達(dá)80.8%，特異性可達(dá)100%，如圖2所示。

圖2 miRNA-335對(duì)成人AML診斷的SROC曲線

3 討論

臨床上急性白血病的診斷分型主要有FAB和MICM兩種方法。前者操作簡(jiǎn)便、不需昂貴的儀器設(shè)備，但主觀性強(qiáng)，分型準(zhǔn)確率低，無法實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化操作。而WHO推出的MICM分型方法比單純的形態(tài)學(xué)分型更為全面、合理，對(duì)治療選擇與預(yù)后判斷具有更大的指導(dǎo)意義，但操作繁瑣，費(fèi)用昂貴。無論是MICM分型還是FAB形態(tài)學(xué)分型，其檢測(cè)樣本都需經(jīng)過腰穿才能取得，增加了患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。故針對(duì)急性白血病，尋找無創(chuàng)診斷與分型的生物學(xué)標(biāo)志物成為研究的熱點(diǎn)。microRNA的發(fā)現(xiàn)是人類進(jìn)一步認(rèn)識(shí)腫瘤的里程碑，自miR-15a首次作為B型慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)發(fā)病機(jī)理影響因素出現(xiàn)[8]，已有眾多研究發(fā)現(xiàn)microRNA在腫瘤中診斷、治療、分類、預(yù)后及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方面的角色[9]。

本研究結(jié)果顯示，在排除病例性別、年齡影響后，AML患者血清循環(huán)miR-335表達(dá)量顯著升高，明顯高于健康對(duì)照組，提示miR-335可作為AML診斷標(biāo)志物之一。接著我們繪制ROC曲線并計(jì)算曲線下面積AUC，0.915的AUC證明miR-335對(duì)AML較高的診斷價(jià)值。選擇最優(yōu)的cutoff值(2.7)，miR-335正確診斷AML患者的概率為80.8%，而排除AML的概率達(dá)到100%。歸納起來，AML患者血清循環(huán)miR-335顯著升高，對(duì)AML的診斷具有較高的診斷效能。與本研究結(jié)果相同，Lin等人首次發(fā)現(xiàn)miR-335水平在兒童AML患者的顯著性高表達(dá)，提示miR-335可作為控制并預(yù)測(cè)臨床兒童AML疾病發(fā)展的重要標(biāo)志物[10]。

近年研究相繼證實(shí)，眾多miRNAs在AML中均存在著異常表達(dá)。miR-99a和miR-196b與兒童急性白血病的進(jìn)展相關(guān)[11,12]；Ovcharenko和Bryant的研究均發(fā)現(xiàn)NPM1突變AML高表達(dá)miR-10a[13,14]；而Ling等發(fā)現(xiàn)AML患者進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-29a和miR-29b表達(dá)異常[15]；Amanda等人研究髓系白血病細(xì)胞系A(chǔ)ML-193后也提示miR-590-5p、miR-219-5p、miR-15b 、miR-628-5p的表達(dá)與AML的發(fā)生相關(guān)[16]；同樣，基因表達(dá)譜的篩查研究也提示miR-223和miR-222可能通過改變急性白血病致癌基因ETS1的表達(dá)而導(dǎo)致白血病發(fā)生[17,18]。我們猜測(cè)，這些異常表達(dá)的miRNAs均有作為AML特征性診斷標(biāo)志物的潛力，這將有待于進(jìn)一步的前瞻性研究進(jìn)行證實(shí)。

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