線性探針技術和傳統基因檢測技術在耐藥結核病診斷中的可靠性和及時性對比

韓珍，林日文，駱妙卡

(惠州市結核病防治研究所，廣東 惠州516008)

結核病(Tuberculosis，TB)是可造成人類死亡的常見感染性疾病，是全球公共衛生面臨的重大威脅[1]。近年來耐藥結核病的發病率不斷上升，耐藥結核病是結核病控制的難題。TB的早期特異性診斷和及時治療、及時切斷傳播鏈并保護易感人群對結核病的治療和預防具有重要意義[2]。細菌學早期診斷是結核病防治的關鍵，抗酸染色、羅氏固體培養等傳統TB診斷技術操作簡單、經濟、方便，易于推廣，但也存在耗時長、敏感度和特異性差、難以標準化等不足，無法滿足臨床需求[3，4]。隨著醫療技術的發展，分子線性探針雜交技術檢測結核病的臨床應用得以推廣[5]。然而目前國內外關于分子線性探針技術和傳統基因檢測技術在耐藥結核病診斷中的可靠性和及時性分析比較少。本研究比較MTBDR plus技術和傳統基因檢測技術診斷耐藥TB的結果。準確性、敏感度、特異度、Kappa值及出報告所需時間，為耐藥TB的早期診斷方法的選擇提供依據，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 連續納入2014年1月至10月期間我院收治的246例涂陽肺結核患者作為研究對象。246例患者中男127例，女119例，年齡19~79歲，平均年齡(42.52±8.78)歲，患者均無其他呼吸系統疾病或嚴重心肺肝腎功能障礙。

1.2 檢測方法

1.2.1 痰標本的收集 每例例涂陽肺結核患者均留取連續3d共3份痰標本，將獲取標本置于4℃冰箱中保存并于留取標本3d內完成耐藥情況的診斷。痰標本的分離和培養均嚴格按照中國防癆協會《結核病診斷實驗室檢驗規程》的要求進行。

1.2.2 傳統藥敏實驗 對分離出的菌株進行結核分枝桿菌菌種進行鑒定并進行異煙肼和利福平藥敏實驗，菌株鑒定采用對硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼鑒別培養基進行生長實驗。藥敏實驗參照WHO/IUATLD標準，菌株培養采用中和離心法，使用接種環取一環培養基上的菌落制成1mg/ml的懸液并梯度稀釋為10-2和10-4mg/ml，分別接種于含40μg/ml利福平和0.2μg/ml異煙肼的羅氏固體培養集中。將標本置于37℃恒溫箱中培養，培養時間為6周。培養完成后讀取菌落數并計算耐藥百分比，耐藥百分比低于1%為敏感，耐藥百分比高于1%為耐藥，同時出現異煙肼和利福平耐藥為耐多藥。實驗操作均嚴格按照中國防癆協會 《結核病診斷實驗室檢驗規程》要求進行，所用培養基均由Basco公司提供。

1.2.3 MTBDR plus線性探針技術檢測 每例患者均取1份陽性級別最高的痰標本進行檢測，檢測試劑盒為德國Hain Life Sciences公司的GenotypeRMTBDR plus試劑盒，具體操作步驟如下：將標本進行消化后制成重懸液，將500μl重懸液加入離心管內5000r/min離心10min后去掉上清液并加入100μl的裂解緩沖液，將重懸液進行渦旋震蕩后于95℃水中水浴5min，5000r/min離心 1min后去掉上清液再次加入100μl的裂解緩沖液，將重懸液進行渦旋震蕩5s，再次5000r/min離心5min。取上清液5μl加入預先配置好的PCR擴增體系中，擴增循環為95℃擴增15min、95℃擴增30min、56℃擴增 3min，共 10個循環；然后 95℃擴增 25s、53℃擴增 40s、70℃擴增 40s，共20個循環；最后 70℃擴增8min。擴增完成后將產物與探針試紙條進行雜交，根據顯色結果進行耐藥性的判讀。

1.2.4 傳統核酸擴增技術檢測 檢測方法參照參考文獻[6]，將痰標本進行去污處理，取0.5μl痰標本提取DNA模版進行擴增加后進行耐藥性分析。

1.3 線性雜交技術結果判讀 試紙條共27個反應條帶和4各區域，第1區為對照質控帶，其他區為耐藥相關基因探針區，其中第2區是利福平耐藥相關rpoB基因探針區，第3、4區分別為與異煙肼耐藥相關的KatG、inhA基因探針區，野生條帶均顯色而突變條帶無顯色時為敏感，野生條帶缺失和突變條帶顯色或不顯色均為耐藥。

1.4 統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行統計學數據處理，計數資料比較采用卡方檢驗，計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗，采用敏感度和特異度對檢測結果的真實性進行評價，采用準確性對檢測方法的應用價值進行評價，采用Kappa值分析MTBDR plus技術、核酸擴增檢測技術與傳統藥敏實驗方法檢測結果的一致性，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTBDR plus技術、核酸擴增檢測技術檢測結果比較 MTBDR plus技術與傳統藥敏實驗檢測所得利福平耐藥結核病發生率、異煙肼耐藥結核病發生率和耐多藥結核病發生率比較差異均無統計學意義(P>0.05)。核酸擴增檢測技術檢測所得利福平耐藥結核病發生率、異煙肼耐藥結核病發生率和耐多藥結核病發生率則均低于傳統藥敏實驗檢測所得結果，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 MTBDR plus技術、核酸擴增檢測技術檢測結果比較[n(%)]

2.2 MTBDR plus技術、核酸擴增檢測技術診斷耐藥結核病的準確性比較 與核酸擴增檢測技術比較，MTBDR plus技術檢測利福平耐藥、異煙肼耐藥和耐多藥的敏感度、Kappa值均較高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2、表3和表4。

表2 MTBDR plus技術、核酸擴增檢測技術診斷利福平耐藥的準確性比較

表3 MTBDR plus技術、核酸擴增檢測技術診斷異煙肼耐藥的準確性比較

表4 MTBDR plus技術、核酸擴增檢測技術診斷耐多藥的準確性比較

2.3 MTBDR plus技術、核酸擴增檢測技術出報告時間比較 MTBDR plus技術出報告時間0.5~2d，平均出報告時間為(1.26±0.58)d，核酸擴增出報告時間 4~15d，平均出報告時間為(8.89±1.08)d，MTBDR plus技術出報告時間顯著短于核酸擴增檢測技術出報告時間，差異有統計學意義 (t=13.82，P<0.01)。

3 討論

近年來我國耐藥結核病的發病率不斷上升，作為全球27個耐藥結核病高發國家之一，我國初診結核病患者中約5%的患者為耐藥結核病患者，而復發結核病患者中約1/4的患者為耐藥結核病患者[7，8]。目前地市級醫院由于實驗室診斷能力落后，結核耐藥診斷報告往往需數月時間，耐藥診斷結果的滯后性可明顯影響治療效果，耐藥結核患者無法得到及時有效的治療且耐藥結核病的傳播無法得以控制[9,10]。傳統耐藥檢測耗時長且靈敏性和特異性均較低，無法滿足耐藥結核病早期準確診斷的需求[11]。線性探針技術可通過對耐藥相關基因的PCR擴增和反向雜交確定結核分枝桿菌對利福平和異煙肼的耐藥性，報告可于24h內獲得，具有快速準確的特點[12,13]。國外研究表明，線性探針技術用于涂陽痰標本檢測的敏感度和特異度均較高[14]。2008年世界衛生組織亦推薦線性探針技術可應用于低收入國家耐藥結核病的診斷[15]。然而目前國內關于線性探針技術診斷結合耐藥性的可靠性和及時性的研究報道甚少。明確線性探針雜交技術和傳統基因檢測技術檢測耐藥結核病的準確度和所需時間可為耐藥結核病的早期診斷和疾病的控制提供指導。

本研究結果顯示，分子線性探針雜交技術檢測所得利福平耐藥結核病、異煙肼耐藥結核病及耐多藥結核病的發病率與傳統藥敏檢測結果相近，而傳統基因檢測技術檢測所得分子利福平耐藥結核病、異煙肼耐藥結核病及耐多藥結核病的發病率低于分子線性探針雜交技術和傳統藥敏實驗檢測結果。傳統基因檢測診斷利福平耐藥結核病、異煙肼耐藥結核病及耐多藥結核病的特異性和準確性均較高，說明傳統基因檢測在耐藥結核病的診斷中具有一定價值，然而其敏感度和Kappa值均較低，傳統基因檢測在耐藥結核病檢測中的準確性有待提高。而分子線性探針雜交技術檢測診斷耐藥結核病的敏感度、特異性、準確性及Kappa值均較高，分子線性探針雜交技術檢測診斷耐藥結核病具有較好的可靠性。分子線性探針雜交技術檢測診斷耐藥結核病出報告的時間短，可于2d內給出耐藥結核病診斷報告，而傳統基因檢測耗時長，出報告時間需約10d，分子線性探針雜交技術檢測診斷耐藥結核病具有較高的及時性。線性探針雜交技術可通過異煙肼和利福平等耐藥相關基因的檢測來完成耐藥結核分枝桿菌的檢測，有助于耐藥TB的早期診斷和及時治療。由于實驗室檢測受操作人員水平、環境等多方面因素的影響，因此明確線性探針技術和傳統基因檢測技術在結核病診斷中的可靠性和及時性需進一步全面深入研究。

綜上所述，分子線性探針技術較傳統基因檢測技術可更及時、準確地診斷耐藥結核病，同時具有較高的可靠性，是耐藥結核病診斷的有效方法。

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