血清mi R-132和mi R-212表達在肝硬化檢測中的意義

王永良

(龍門縣人民醫(yī)院，廣東 龍門516800)

Selmi C最初發(fā)現(xiàn)原發(fā)性膽汁性肝硬化患者血清中miR-132和miR-212的表達均有變化，miR-132與miR-212在血清中的表達與免疫力相關[1]。故近5年多項研究均將miR-132與miR-212的靶向作用進行研究，miR-132已被確認為血管再生開關因子，miR-212已被確認為細胞有絲分裂開關因子。此二者對肝硬化的修復過程均具有現(xiàn)實意義[2，3]。肝硬化患者的miR-132和miR-212的表達均有降低，檢測血清miR-132和miR-212對肝硬化的診斷具有積極意義。

表1 患者一般資料表

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011年4月至2014年4月來我院參與肝硬化治療的患者63例，其中男性42例，女性21例，年齡 32~67歲，平均年齡 45±1.2歲。所有患者均為龍門地區(qū)漢族人群。患者合并腹膜炎的33例，腸系膜炎32例，門靜脈高壓患者41例，淤血性脾大患者39例，腹水患者17例。全部患者有飲酒史，日均飲酒50ml以上的21例。所有患者中，代償期肝硬化22例，失代償期肝硬化患者41例。見表1。

1.2 標本采集方法 采用一次性真空采血管采集患者空腹靜脈血5ml。置于離心機中，使用10000r/min轉速離心10min。取上清液(血清)置于-80℃保存。

1.3 RNA提取方法 取樣本血液1ml，置于離心機中10000r/min離心處理1.5min。取血清200μl加入200μlTrizol裂解劑，充分震蕩，提取總RNA。

1.4 PCR反應及miRNA逆轉錄方法 提取的RNA溶解于 11 μl DEPC-treated water， 加入 1μl Oligo(dT)18 primer(0.5μg/μl) 輕微震蕩后離心 3~5s，在PCR擴增儀上70℃5min。冰上冷卻，并短暫離心，向反應體系中加入 5×reaction buffer 4μl，Ribolock-TMRibonuclease inhibitor(20U/μl)1μl，10 mM dNTP mix 2μl。輕微震蕩后離心3~5s，在PCR擴增儀上37℃ 5min。向反應體系中加入 RevertAidTMMMuLV Reverse Transcriptase(200U/μl)1μl，在 PCR擴增儀上42℃ 60min，70℃ 10min。引物設計使用廣州銳博公司的標準序列。退火溫度為60℃，產(chǎn)物片段106bp，以U6標準作為內(nèi)參考[4]。

1.5 生化分析方法 備份血液樣品進行GGT、ALP、ALT及TBil等肝功能項目檢測，使用生化分析儀及配套試劑完成[5-8]。所有操作均按說明書嚴格操作，因此操作過程與本文實質(zhì)研究結果并無直接關系，在此不做贅述。

1.6 統(tǒng)計學方法 用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行。計量資料用x+s表示；多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，多組數(shù)據(jù)兩兩間的比較采用 LSD-t檢驗，兩變量之間關系采用 Pearson相關性分析;以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 生化及臨床檢測結果 在總膽紅素(T Bil)、直接膽紅素(D Bil)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)和γ-谷氨酰基轉移酶(GGT)等指標中，研究組均與實驗組具有明顯差異，特別是代表肝臟損傷的ALP和GGT指標，研究組明顯高于健康組。膽堿脂酶(CHE)C反應蛋白(CRP)血沉(ESR)兩組患者基本相似。見表2。

表2 各組對象生化及臨床指標對比表(±s)

表2 各組對象生化及臨床指標對比表(±s)

參數(shù) 研究組 健康組 F P TBil(μmol/L)DBil(μmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)ALP(U/L)GGT(U/L)CHE(KU/L)CRP(mg/L)ESR(mm/h)46.4±13.8 24.9±9.8 66.3±12.7 81.2±26.7 332.1±123.5 102.9±18.9 6.8±4.1 4.1±2.1 14.2±8.9 16.6±5.3 4.3±2.6 30.7±4.6 36.2±6.2 77.3±16.5 23.4±7.8 7.3±4.0 4.6±1.6 13.7±7.8 8.7 10.6 9.8 8.8 22.2 36.4 4.8 5.3 5.1 0.012 0.001 0.003 0.031 0.029 0.017 0.124 0.063 0.057

2.2 miR-132和miR-212的表達水平 兩組患者的miR-132和miR-212的表達水平均有所降低，特別是miR-132降低幅度較大。而部分患者的miR-212水平出現(xiàn)了升高，但此部分患者占肝硬化患者的一小部分。也就是說，肝硬化患者的miR-132和miR-212均出現(xiàn)了波動，miR-132以下降為主，下降幅度在50%以上，而miR-212除極少部分偏高外，絕大部分都出現(xiàn)了一定程度的下降。見表3。

表3 各組研究對象血清miR-132和miR-212的表達水平對比(x±s)

3 討論

目前普遍認為miR-132是血管生長的刺激因子，miR-132升高時，血管的修復能力增加，毛細血管更加發(fā)育。而當miR-132下降時，機體的自我修復能力表現(xiàn)低迷，機體愈合能力降低。miR-132無疑為肌體特別是血管修復的“開關因子”。miR-212因子是刺激細胞分裂的因子，當miR-212因子升高時，細胞分裂更加活躍，而當miR-212因子降低時，細胞分裂活動比較緩慢。事實上，目前的癌癥信息素治療方案中，有效地抑制miR-132和miR-212因子，可以有效地調(diào)節(jié)癌癥發(fā)生和惡化的概率。而肝硬化患者體內(nèi)的miR-132降低抑制了肝臟的自我修復，而miR-212的波動，引起了肝臟內(nèi)局部異常增生或者同步造成了肝臟的自我修復能力降低。

Selmi C等[1]對肝硬化的免疫功能改變進行了研究，特別研究了肝硬化患者手術康復期的免疫能力變化。肝硬化患者的免疫力在本文研究中出現(xiàn)了普遍下降，比非肝硬化組出現(xiàn)炎性癥狀的概率明顯升高。Dai R等[9]研究了自身免疫對于源發(fā)膽汁肝硬化的病理作用。原發(fā)性膽汁性肝硬化是導致miR-212升高的主要原因，在原發(fā)性膽汁性肝硬化條件下，miR-132下降幅度更加明顯，而miR-212更傾向于發(fā)生升高的變化。Murata K等[10]研究了風濕性關節(jié)炎和骨膜炎患者的miR-132和miR-212表達。miR-132與miR-212在風濕性關節(jié)炎和骨膜炎患者血清中的表達與肝硬化類似，此兩類患者的miR-132和miR-212表達均出現(xiàn)了較明顯的下降，且miR212降低的幅度大于肝硬化患者。Wei X等[11]研究了病毒性肝癌患者的miR-132和miR-212表達。本文研究同步發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者的miR-132和miR-212表達會出現(xiàn)顯著變化，miR212出現(xiàn)下降而miR-132在肝硬化體質(zhì)的基礎上出現(xiàn)升高。這與肝硬化患者的免疫力下降是同步的。

Heathcote EJ等[12]對肝臟疾病進行了統(tǒng)觀性的研究。徐蕓等及陳燕等對肝硬化患者的相關體征檢查數(shù)據(jù)進行了匯總，并且做出了統(tǒng)觀性研究[13，14]。 從某種意義上，miR-132 和 miR-212 表達是肝硬化患者的一個體質(zhì)特征，本文雖然沒有對miR-132和miR-212表達于肝硬化的形成產(chǎn)生明顯的相關性結論，但足以證明miR-132和miR-212表達與肝硬化體質(zhì)具有直接的關系。

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