糞便隱血膠體金法和氨基比林法的對比及意義

伍志蓮，賴書臺

(韶關市曲江區人民醫院檢驗科，廣東 韶關512100)

2011年美國癌癥學會(American Cancer Society，ACS)最新發布的全球癌癥統計報告稱，食管、胃、肝臟、結直腸等消化系統臟器的癌癥發生率和死亡率在發展中國家均占前十位[1]。上消化道出血量小于5ml時肉眼看不到血液存在；紅細胞受到破壞時，糞便顯微鏡檢查也見不到紅細胞；此時只有通過糞便隱血試驗才能證明有無出血。在臨床的日常診療中糞便隱血試驗非常重要。許多臨床研究證明，糞便微量出血是結腸直腸癌最早期的癥狀。所以對糞便中微量出血的檢出尤其是在胃腸消化道腫瘤及出血的早期診斷方面具有十分重要的意義。我們在臨床檢驗工作中經常遇到黑色柏油樣糞便隱血試驗陰性，而臨床上高度懷疑上消化道出血的情況。為了解其原因，我們做了膠體金免疫法和氨基比林半定量法(化學法)的糞便隱血試驗對比，并對其結果進行了分析。

1 材料與方法

1.1 一般資料 2013年1月至2014年12月間我院住院及門診確診為上消化道出血的患者的黑色柏油樣糞便100例，同時段正常外觀黃色軟糞便100例(健康者提供)。患者年齡在25~90歲之間，平均年齡45歲，男61例，女39例。

1.2 試劑

1.2.1 便隱血(FOB)檢測試劑(膠體金法)由艾博生物醫藥(杭州)有限公司提供。

1.2.2 氨基比林半定量法 (化學法)試劑：(1)5%氨基比林溶液：稱取氨基比林5克溶于50ml冰醋酸和50ml無水乙醇的混合液中搖勻，置棕色瓶中保存。(2)3%過氧化氫溶液：吸取10ml30%過氧化氫溶液加90ml蒸餾水混勻。置棕色瓶中保存(注意3%過氧化氫容易失效，試驗時應做陽性對照)。

1.3 方法

1.3.1 便隱血(FOB)檢測試劑(膠體金法)檢測原理采用雙抗體夾心法，試劑含有被事先固定于膜上檢測區(T)的抗人血紅蛋白和質量控制區(C)的相應抗體。測試時，試劑插入樣本中，隨之在毛細效應作用下向上層析。如果糞便中含有人血紅蛋白，則形成金標記抗人Hb單抗-糞Hb-羊抗人Hb多抗復合物[2]，在檢測區(T)內出現一條紫紅色條帶(陽性結果)。如果糞便中無人血紅蛋白，則檢測區(T)內將無紫紅色條帶。無論人血紅蛋白是否存在于樣本中，一條紫紅色帶都會出現在質量控制(C)內。質量控制區(C)所顯現的紫紅色條帶是判斷是否有足夠樣本，層析過程是否正常的標準，同時也作為試劑的內控標準。檢測方法及注意事項均嚴格按試劑說明書操作，試劑在有效期內使用。操作：在樣品杯中加入約0.5ml蒸餾水，用竹簽挑取約火柴頭大小的新鮮糞便標本放入杯內混勻；從包裝紙中取出試劑條，將試劑條的箭頭所指端浸入樣本溶液中 (液面不能超過MAX標記線)，5~10min判讀結果。

1.3.2 氨基比林半定量法(化學法)原理 血紅蛋白中的亞鐵血紅素有類似過氧化物酶的活性，能催化H2O2作為電子受體使氨基比林氧化而顯紫藍色，其顏色的深淺與血紅蛋白含量成正比。操作：用竹簽挑取約火柴頭大小的新鮮糞便標本，置于白色背景上，依次加2~3滴5%氨基比林溶液，2~3滴3%過氧化氫溶液。立即觀察結果，在2min內出現紫藍色為陽性。并根據顏色深淺記錄(以“+”表示)。

1.3.3 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件分析，計數資料采用率表示，數據比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

正常外觀黃色軟便膠體金免疫法陽性率為8%(8/100)，氨基比林半定量法陽性率為2%(2/100)，兩種方法同時陽性為0；黑色柏油樣便膠體金免疫法陽性率為77%(77/100)，氨基比林半定量法陽性率為100%，膠體金法與氨基比林半定量法隱血試驗的陽性率對照差異有統計學意義 (P<0.05)，見表 1。

表1 糞便隱血2種方法結果

3 討論

美國臨床化學學會[3]和中華醫學會檢驗分會[4]均推薦糞便隱血試驗作為結直腸癌的篩查指標。糞便隱血試驗的方法主要有化學法、免疫法、血紅蛋白熒光測定法、放射性核素鉻(51Cr)法、轉鐵蛋白(Tf)法等。化學法主要包括鄰聯甲苯胺法、氨基比林法、愈創木酯法等；西班牙學者研究提示免疫法糞便隱血試驗是目前結直腸癌篩查的最適合手段[5]。目前臨床采用較多的免疫法是單抗免疫膠體金法，該方法被世界衛生組織胃腸鏡檢查協會推薦為糞便隱血試驗的一種較為確認的方法[6]。其原理是膠體金是由氯化金和枸櫞酸合成的膠體物質，呈紫紅色。膠體金與羊抗人血紅蛋白單克隆抗體(羊抗人Hb單抗)和鼠IgG吸附在特制的乙酸纖維膜上，形成一種有標記抗體的膠體金物質，再在試帶的上端涂上包被羊抗人Hb多抗和羊抗鼠IgG抗體[2]作為試劑質控對照線。氨基比林半定量法的特點是中靈敏度、中特異性，Hb 1~5mg/L即可檢出，消化道有5~10ml出血即為陽性[2]。從表1可以看出當糞便外觀呈正常黃軟便時氨基比林半定量法陽性有2例，膠體金免疫法陽性有8例。兩種方法同時陽性為0；可見膠體金免疫法靈敏度高于氨基比林半定量法，當糞便外觀呈黑色柏油樣便時氨基比林半定量法陽性100例(100%)，膠體金免疫法陽性77例(77%)。此時氨基比林半定量法的靈敏度高于膠體金免疫法。可見氨基比林半定量法可以滿足臨床需求。

表中還可看出，在黑色柏油樣糞便中膠體金免疫法有23例陰性。說明膠體金免疫法存在假陰性。其原因可能有以下幾個方面：上消化道出血量大時Hb濃度過高，Hb、Hb-Hb抗體復合物和抗Hb競爭結合，抑制了膠體金顆粒聚集(后帶現象)，導致假陰性[7]，此時可稀釋糞便標本再復查；患者的血紅蛋白抗原與單克隆抗體不相匹配而出現假陰性[8]；糞便標本中的紅細胞或Hb在消化道內時間較長時，珠蛋白鏈可能會被胃液及蛋白酶水解和降解破壞，從而失去能特異結合單克隆抗體的抗原決定簇，使其失去免疫原性而出現假陰性[9]；還有可能觸珠蛋白和糖化血紅蛋白等屏蔽抗原決定簇從而引起假陰性；此外，胃腸道內的各種細菌作用也有可能使血紅蛋白失去免疫活性，導致假陰性。

化學法隱血試驗易受多種因素影響而呈假陽性反應[10]。試驗結果顯示，黃色軟便中氨基比林半定量法陽性2例，可能是食入動物肉類、鐵劑等產生的假陽性；膠體金免疫法陽性8例臨床證實有不同程度的胃潰瘍、痔瘡等。總之，在臨床診療中必須了解各種方法的局限性。如免疫法不受動物血紅蛋白的干擾，而化學法無法排除此干擾[11]，林召等[12]認為免疫金標法隱血試驗主要檢測下消化道出血,約有40%~50%的上消化道出血不能檢出，高于本文的23%。由于免疫法只能定性檢測，而化學法大致能估計出血量(半定量)，且利于觀察消化道出血病人的療效。因此,化學法檢查上消化道出血(胃、十二指腸等)可靠[13]。膠體金免疫法的特異性只針對糞便中的人血紅蛋白,當樣品中血紅蛋白濃度超過0.2μg/ml時，就可得到陽性結果[14]，而且此實驗不受其它動物肉類血紅蛋白干擾，含過氧化物酶的新鮮蔬菜,鐵劑,維生素C及對化學法有干擾作用的某些藥物對此法的結果均無影響[15]。所以在日常臨床工作中應該以膠體金法作為主要隱血檢測手段[16]。當黑色柏油樣便膠體金法陰性時，可以通過氨基比林半定量法(化學法)糾正結果，以提高糞便隱血的準確性。

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