高內(nèi)涵篩選技術(shù)的原理及其在生態(tài)毒理學(xué)的應(yīng)用

黃超，言野，李娜，馬梅，王子健

中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 中國(guó)科學(xué)院飲用水科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085

高內(nèi)涵篩選技術(shù)的原理及其在生態(tài)毒理學(xué)的應(yīng)用

黃超，言野，李娜，馬梅*，王子健

中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 中國(guó)科學(xué)院飲用水科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085

大量存在于環(huán)境中的有毒污染物仍然缺乏足夠的毒理學(xué)數(shù)據(jù)來對(duì)其進(jìn)行有效的監(jiān)管，為了滿足海量化合物毒性評(píng)價(jià)的需要，基于離體生物測(cè)試的高通量毒性篩選方法在近些年得到了迅猛的發(fā)展。高內(nèi)涵篩選技術(shù)是新型的高通量化合物毒性篩選方法，該方法最顯著的特點(diǎn)是能夠在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整的基礎(chǔ)上同時(shí)獲取多種毒性指標(biāo)。因此在簡(jiǎn)介高內(nèi)涵篩選技術(shù)原理的基礎(chǔ)上，綜述了其在生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域已有的應(yīng)用，并針對(duì)性地對(duì)高內(nèi)涵篩選技術(shù)的發(fā)展和挑戰(zhàn)進(jìn)行了展望。

高內(nèi)涵篩選；高通量篩選；離體毒性測(cè)試；生態(tài)毒理學(xué)

隨著現(xiàn)代工業(yè)進(jìn)步，人類合成、使用和間接產(chǎn)生的化合物的數(shù)量和種類在不斷增長(zhǎng)，其中包括了化工原料、阻燃劑、農(nóng)藥、增塑劑、食品添加劑、藥物、天然化合物及衍生物、飲用水消毒副產(chǎn)物和化學(xué)合成副產(chǎn)物等多個(gè)類別[1-2]。然而由于在對(duì)化合物毒性作用方面認(rèn)識(shí)的不足，絕大多數(shù)的化合物缺乏有效監(jiān)管，部分化合物因此能夠以直接或間接的方式進(jìn)入環(huán)境，成為環(huán)境污染物。事實(shí)上，根據(jù)美國(guó)國(guó)家毒理規(guī)劃處(NTP)生物分子篩選部負(fù)責(zé)人Tice等[2]在2013年的估計(jì)，至少有數(shù)萬(wàn)種存在于環(huán)境中的污染物仍然缺乏足夠的毒理學(xué)數(shù)據(jù)來預(yù)測(cè)其對(duì)人類和生態(tài)系統(tǒng)的影響。所以在生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域，對(duì)這些化合物展開環(huán)境危害性和毒理特性鑒定，進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)管理顯得尤為必要而迫切。為此，美國(guó)環(huán)境保護(hù)局(EPA)在2011年已開始推進(jìn)新一代的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估(NexGen)項(xiàng)目，NexGen項(xiàng)目強(qiáng)調(diào)了體外高通量毒性篩選在揭示化合物毒性作用機(jī)制方面的重要性[3]，而該項(xiàng)目的實(shí)施對(duì)中國(guó)的毒理學(xué)發(fā)展具有借鑒意義。

模式動(dòng)物的活體毒性測(cè)試由于通量低、成本高和周期長(zhǎng)已不能滿足當(dāng)前巨量化合物毒性評(píng)價(jià)的需要，為了應(yīng)對(duì)毒理學(xué)領(lǐng)域所面臨的新挑戰(zhàn)，2007年加拿大國(guó)家研究委員會(huì)(NRC)的“21世紀(jì)毒性測(cè)試:一種遠(yuǎn)見與策略”報(bào)告[4]為毒理學(xué)領(lǐng)域新世紀(jì)的發(fā)展奠定了基石。該報(bào)告不僅提出了21世紀(jì)毒性測(cè)試應(yīng)當(dāng)從活體生物檢測(cè)向高通量的離體檢測(cè)轉(zhuǎn)變，更期望采用離體生物檢測(cè)去揭示化合物毒性作用機(jī)制，從而使在這個(gè)框架下所進(jìn)行的風(fēng)險(xiǎn)科學(xué)具有充分的科學(xué)依據(jù)。毒性作用機(jī)制的研究是以毒性途徑紊亂(perturbations of toxicity pathways)為觀察指標(biāo)[4]，這一特點(diǎn)與傳統(tǒng)離體或活體生物檢測(cè)中，以死亡、突變、腫瘤形成等細(xì)胞或動(dòng)物終點(diǎn)事件(apical end points)為觀察指標(biāo)所不同。而所謂的毒性通路在NRC的報(bào)告中被定義為：正常細(xì)胞受外來化合物干擾后所產(chǎn)生的，能導(dǎo)致?lián)p害健康效應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)應(yīng)答通路[4]。為了對(duì)這一觀察指標(biāo)進(jìn)行全面的衡量，新的高通量生物檢測(cè)方法仍然有待進(jìn)一步的發(fā)展。

高內(nèi)涵篩選(High Content Screening, HCS)是新型的高通量化合物毒性檢測(cè)方法，能夠在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整的基礎(chǔ)上，運(yùn)用多種熒光標(biāo)記物標(biāo)記細(xì)胞，自動(dòng)化地對(duì)細(xì)胞內(nèi)多靶點(diǎn)的復(fù)雜表型(phenotype)進(jìn)行篩選[5-7]。不同篩選條件下產(chǎn)生的表型特征既包括了完整細(xì)胞所表現(xiàn)的凋亡、壞死、增殖、遷移等形式，還包括了細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器損傷、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝途徑以及遺傳損傷等[8]。不同于傳統(tǒng)離體生物檢測(cè)中以細(xì)胞內(nèi)單靶點(diǎn)的作用為檢測(cè)端點(diǎn)，HCS以高內(nèi)涵(high content)的方式呈現(xiàn)化合物暴露下所產(chǎn)生的多維表型信息[9]，從而系統(tǒng)的對(duì)化合物的毒性作用機(jī)制展開研究[10]，更好的對(duì)化學(xué)污染物進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

當(dāng)前隨著HCS設(shè)備及分析技術(shù)的長(zhǎng)足的進(jìn)步，HCS技術(shù)已在毒理學(xué)、藥理學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有了極大的發(fā)展，在生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域，HCS的應(yīng)用亦在積極的展開。本文系統(tǒng)介紹了HCS技術(shù)原理，在此基礎(chǔ)上總結(jié)了HCS在當(dāng)前生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，并對(duì)其發(fā)展前景和所面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行了展望。

1 HCS技術(shù)原理

1.1 HCS概念

光學(xué)顯微鏡設(shè)備在自動(dòng)化程度和圖像收集速率的提高促進(jìn)了HCS的發(fā)展，研究人員已可以利用圖像分析方法在單細(xì)胞水平展開研究。因?yàn)镠CS以完整細(xì)胞為研究對(duì)象，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整，真實(shí)反應(yīng)了細(xì)胞內(nèi)的毒性作用機(jī)制[11]。細(xì)胞熒光圖像是HCS獲取數(shù)據(jù)的主要手段，特異性熒光探針或熒光蛋白的采用使細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)被多種熒光信號(hào)同時(shí)標(biāo)記，從而反應(yīng)細(xì)胞表型。能夠被HCS檢測(cè)得到的表型變化除包括標(biāo)記點(diǎn)的熒光強(qiáng)度改變外，還有細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)形態(tài)變化。圖像分析技術(shù)使得表型變化的定量分析成為可能，每個(gè)細(xì)胞的熒光和形態(tài)學(xué)特征得以被聚類和分類等數(shù)據(jù)挖掘手段所整合分析，從而轉(zhuǎn)換為可解釋的多維細(xì)胞表型信息，這種多生物學(xué)信息呈現(xiàn)方式拓寬了我們對(duì)化合物毒性作用機(jī)制的理解和認(rèn)識(shí)。

1.2 HCS實(shí)驗(yàn)流程

HCS的試驗(yàn)流程包括了細(xì)胞培養(yǎng)、樣品制備和暴露、圖像獲取、圖像分析和數(shù)據(jù)挖掘5個(gè)部分[5]，同時(shí)，基于高性能工作站和服務(wù)器建立起來的數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)對(duì)于HCS數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)和調(diào)用分析也至關(guān)重要[12]，以下對(duì)HCS過程中幾個(gè)關(guān)鍵步驟進(jìn)行相關(guān)介紹。

1.3 樣品制備和暴露

常規(guī)的HCS過程同樣依賴于實(shí)驗(yàn)員的操作，需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、化合物暴露和細(xì)胞染色等一系列樣品前處理過程，這在大規(guī)模高通量化合物的HCS中會(huì)造成了2方面的影響，一方面384、1536等多孔板的應(yīng)用增加了實(shí)驗(yàn)員的操作難度；另一方面，實(shí)驗(yàn)員在操作的過程中容易引入人為誤差，整個(gè)實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制難以保證[13]。因此在大規(guī)模高通量的HCS中，樣品制備和暴露更依賴于自動(dòng)化的液體處理設(shè)備，盡管當(dāng)前自動(dòng)化液體處理設(shè)備價(jià)格較高，但其引入使得實(shí)驗(yàn)的整體精度、重復(fù)性和可靠性被極大的增強(qiáng)，并滿足了大部分液體處理的需要。目前，已有多個(gè)生物公司，如Tecan，PerkinElmer等都開發(fā)了自己的液體處理設(shè)備。

1.4 圖像獲取

隨著近幾年顯微鏡領(lǐng)域的發(fā)展，HCS設(shè)備已日趨成熟，主要在檢測(cè)速度、圖像質(zhì)量、共聚焦和厚組織掃描這4個(gè)方面有了極大的進(jìn)步。高速轉(zhuǎn)盤的應(yīng)用使得HCS設(shè)備能夠在短時(shí)間內(nèi)掃描多通道的熒光信號(hào)[14]，降低了檢測(cè)環(huán)境對(duì)細(xì)胞的影響。新型的HCS設(shè)備已采用了基于新一代CMOS圖像傳感器(CIS)設(shè)計(jì)的科學(xué)級(jí)CMOS(sCMOS)。相比于傳統(tǒng)的CCD圖像傳感器，sCMOS不僅能以4倍的視場(chǎng)范圍在短時(shí)間內(nèi)完成高質(zhì)量的圖像掃描，更能細(xì)致的展現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)微觀結(jié)構(gòu)[15]。光路系統(tǒng)的改進(jìn)也增強(qiáng)了HCS設(shè)備共聚焦能力，滿足了以三維細(xì)胞培養(yǎng)為概念的一些新的細(xì)胞及組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展要求。表1總結(jié)當(dāng)前廠商所提供的商品化高內(nèi)涵設(shè)備。

1.5 圖像分析與數(shù)據(jù)挖掘

為了從HCS所獲得圖像中提取所需的生物學(xué)信息，需要對(duì)其進(jìn)行圖像分析和數(shù)據(jù)挖掘[16-17]。圖像分析的主要目的是對(duì)每個(gè)細(xì)胞都進(jìn)行定量化分析，主要包括：(1) 細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)定位；(2) 細(xì)胞結(jié)構(gòu)分割；(3) 線性結(jié)構(gòu)提取(針對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)突)；(4) 細(xì)胞追蹤(針對(duì)活細(xì)胞檢測(cè))；(5) 特征提取共5個(gè)部分[16]。經(jīng)過圖像分析，得到了與圖像信息關(guān)聯(lián)的單細(xì)胞特征，包括了熒光強(qiáng)度、形態(tài)、表面紋理(texture)和位置等多維數(shù)據(jù)。將多維數(shù)據(jù)正態(tài)化后再對(duì)其進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，最廣泛的應(yīng)用是聚類和分類算法，目的是將不同處理下所呈現(xiàn)不同表型特征的細(xì)胞歸入所屬類型[17]，例如根據(jù)DNA含量與細(xì)胞形態(tài)對(duì)處于不同細(xì)胞周期下的細(xì)胞進(jìn)行劃分[18-19]。圖像分析和數(shù)據(jù)挖掘是HCS研究的熱點(diǎn)，只有通過該過程才能闡述圖像背后的生物學(xué)問題。商品化的HCS分析軟件的使用極大的降低了HCS應(yīng)用的難度，是HCS圖像分析和數(shù)據(jù)處理過程中的主流策略，但其使用成本較高，通用性相對(duì)較差。現(xiàn)也有一些較為成熟的高內(nèi)涵分析開源軟件，如由美國(guó)哈佛-麻省理工的博德研究所主導(dǎo)開發(fā)的cellprofiler[20]，可以通過模塊化定制來對(duì)HCS圖像進(jìn)行分析，分析得到的數(shù)據(jù)可以進(jìn)一步采用基于隨機(jī)森林?jǐn)?shù)的機(jī)器學(xué)習(xí)方法來進(jìn)行分選。除此之外，結(jié)合R[21-22]和Weka[23]等數(shù)據(jù)分析軟件，來對(duì)HCS圖像分析經(jīng)過進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、數(shù)據(jù)挖掘和數(shù)據(jù)可視化的應(yīng)用也越來越多。

1.6 生物數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)

Keefer等估計(jì)，一個(gè)HCS平臺(tái)每年數(shù)據(jù)產(chǎn)出量在500 GB～6 TB左右[10]。如此高的數(shù)據(jù)產(chǎn)出，不僅要求在數(shù)據(jù)分析過程中采用并行甚至集群計(jì)算，數(shù)據(jù)的儲(chǔ)存和調(diào)用也依賴于服務(wù)器。但是，幾乎每個(gè)HCS設(shè)備提供商都以各自格式儲(chǔ)存數(shù)據(jù)，這導(dǎo)致顯微實(shí)驗(yàn)中圖像格式冗余，制約了HCS數(shù)據(jù)庫(kù)的管理和維護(hù)[12]。OME以增強(qiáng)HCS分析軟件之間的互通性為目的而開發(fā)的“Bio-format”已得到各個(gè)軟硬件的廣泛支持，使HCS中統(tǒng)一的數(shù)據(jù)管理成為可能[24]。HCS的數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)除了有傳統(tǒng)的商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)Oracle[25]，MDCStoreTM和ColumbusTM等，HCS開源數(shù)據(jù)庫(kù)SIDB[26]和OME的OMERO[27]也有了廣泛的應(yīng)用。

2 HCS在生態(tài)毒理學(xué)的應(yīng)用

對(duì)環(huán)境中有毒有害化合物進(jìn)行毒性篩查，分析其毒性作用機(jī)制是化學(xué)物質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中必要的過程，也正是生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。而HCS最大的優(yōu)勢(shì)是在一次實(shí)驗(yàn)中對(duì)觀測(cè)對(duì)象，如離體培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行多維表型分析，因此也可以同時(shí)得到多組反應(yīng)化合物毒性的指標(biāo)[9]。熒光圖像中毒性指標(biāo)的提取依賴于圖像分析和數(shù)據(jù)挖掘，該過程的目的是對(duì)熒光圖像中的對(duì)象進(jìn)行分割和分類。所以HCS的毒性指標(biāo)既來源于熒光標(biāo)記靶點(diǎn)所在位置和熒光強(qiáng)度，也能在細(xì)胞和亞細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)上反應(yīng)[9]。正因如此，HCS對(duì)于其他毒性評(píng)價(jià)方法中難表征的毒性指標(biāo)，如凋亡小體的形成，信號(hào)通路中轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)位，細(xì)胞趨化和集落形成等也能定量化的測(cè)定。Zock[28]已在其綜述中對(duì)HCS所能得到的毒性指標(biāo)進(jìn)行了較為完整的綜述，總結(jié)在表2中。由于HCS中毒性指標(biāo)的多產(chǎn)出，需要對(duì)其并行分析，這已在生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域展開了眾多實(shí)際的應(yīng)用。而在HCS應(yīng)用較為成熟的藥物篩查過程中，其在化合物作用機(jī)制的研究也對(duì)生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用具有借鑒意義。

2.1 遺傳毒性

遺傳毒性用于描述某化合物能夠直接或間接的方式引起DNA或染色體損傷的性質(zhì)，具有這種性質(zhì)的化合物被稱為遺傳毒物[29]。工業(yè)污染使眾多潛在的遺傳毒物進(jìn)入環(huán)境介質(zhì)，而遺傳毒物對(duì)生物胚胎細(xì)胞和體細(xì)胞的損害可能引起多種疾病，包括了新生兒畸形和癌癥生成等[30]。因此為了對(duì)這些化合物進(jìn)行監(jiān)管，需要對(duì)其遺傳毒性定量測(cè)定，而相比于傳統(tǒng)遺傳毒性評(píng)價(jià)方法，HCS在具有較高的靈敏度和特異性同時(shí)，能夠高通量的檢測(cè)多個(gè)遺傳毒性指標(biāo)，因此應(yīng)用廣泛。

表2 HCS主要的應(yīng)用領(lǐng)域和研究對(duì)象[28]

應(yīng)用領(lǐng)域Feild研究對(duì)象Object應(yīng)用領(lǐng)域Feild研究對(duì)象Object應(yīng)用領(lǐng)域Feild研究對(duì)象Object細(xì)胞信號(hào)通路Cellsignalingpathways靶點(diǎn)驗(yàn)證TargetvalidationNF-κBSTATWnt/fzdPKBNFATP38TGF-betaSmad2/3GPCR糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoidreceptor)FOXO1α酵母(yeast)shRNA干擾文庫(kù)(shRNAinterferencelibrary)siRNA干擾文庫(kù)(siRNAinterferencelibrary)干細(xì)胞自我更新(Stemcellself-renewal)干細(xì)胞分化(Stemcelldifferentiation)細(xì)胞生理學(xué)Cellphysiology增殖(Proliferation)磷酸化(Phosphorylation)吞噬作用(Phagocytosis)自噬作用(Autophagy)間隙連接誘導(dǎo)(Gapjunctioninduction)線粒體健康(Mitochondrialhealth)核形態(tài)(Nuclearmorphology)凋亡(Apoptosis)細(xì)胞膜通透性(Membranepermeability)細(xì)胞周期(Cellcycle)細(xì)胞遷移(Motility/migration)細(xì)胞骨架重拍(Cytoskeletalrearrangement)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)(Neuiteoutgrowth)轉(zhuǎn)化(Transformation)機(jī)體生理學(xué)Organismphysiology離體毒性測(cè)試(InVitroToxicology)心臟衰竭(Cardiacfailure)生物節(jié)律(Circadianrhythms)免疫抑制(Immunosupression)骨質(zhì)疏松(Osteoporosis)真菌致病性(Fungalpathogensis)病毒中和(Virusneutralization)寄生物感染(Parasiteinfection)血管生成(Angiogenesis)阿茲海默綜合征(Alzheimer'sdisease)帕金森綜合征(Parkinson'sdisease)亨廷頓綜合癥(Huntington'sdisease)肌萎縮性側(cè)素硬化(Amyotrophiclateralsclerosis)微核生成(Micronucleusinduction)磷脂沉積(Phospholipidosis)神經(jīng)毒性(Neurotoxicity)細(xì)胞器健康(Organellehealth)肝毒性(Hepatotoxicity)

注：NF-κB，核因子活化B細(xì)胞κ輕鏈增強(qiáng)子；STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白；Wnt/fzd，Wnt/卷曲受體；PKB，蛋白激酶B；NFAT，激活T細(xì)胞核因子；p38，促分裂原活化蛋白激酶；TGF-beta，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β；Smad2/3，母親DPP同源物2；GPCR，G蛋白偶聯(lián)受體；FOXO1α，叉頭基因O1。

Note: NF-κB, nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells; STAT, signal transducer and activator of transcription; Wnt/fzd, Wnt/frizzled; PKB, protein kinase B; NFAT, nuclear factor of activated T-cells; p38, p38 mitogen-activated protein kinases; TGF-beta, transforming growth factor beta; Smad2/3, mothers against decapentaplegic homolog 2; GPCR, G protein-coupled receptor; FOXO1α, Forkhead box O1α.

2.1.1 細(xì)胞周期阻滯

生物的生長(zhǎng)和繁衍依賴于遺傳信息在細(xì)胞中準(zhǔn)確而穩(wěn)定的復(fù)制，為了滿足遺傳信息在復(fù)制過程中的高保真度，細(xì)胞進(jìn)化擁有了一套高效的監(jiān)控機(jī)制—DNA損傷應(yīng)答(DNA Damage Response, DDR)系統(tǒng)[31]。DDR信號(hào)通路與多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路相互關(guān)聯(lián)，其中，一旦DNA發(fā)生了結(jié)構(gòu)性損傷，DDR信號(hào)通路被激活，可能根據(jù)不同的損傷類型和時(shí)間點(diǎn)首先將細(xì)胞阻滯于不同的細(xì)胞周期階段，主要是G1、S和G2期[32]，并在這些階段中嘗試對(duì)DNA損傷進(jìn)行修復(fù)，因此細(xì)胞周期阻滯與DNA損傷具有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。HCS不僅能夠進(jìn)行DNA含量分析[18]，采用數(shù)學(xué)模型來對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行劃分，還能充分利用細(xì)胞形態(tài)特征，采用機(jī)器學(xué)習(xí)的方法來判別更為細(xì)致的細(xì)胞周期狀態(tài)[33]。另外多種熒光探針也能在HCS被用來表征不同的細(xì)胞周期狀態(tài)，例如BrdU[34]和Edu[35]是HCS過程常用的S期熒光標(biāo)記物[19,33]，它們分別是胸腺嘧啶核苷衍生物和類似物，能夠代替胸腺嘧啶(T)滲入進(jìn)S期細(xì)胞的DNA分子中，并通過熒光標(biāo)記識(shí)別。

2.1.2 特定DNA損傷檢測(cè)

DNA損傷具有多種類別，包括了氧化性DNA損傷、DNA加合物、DNA甲基化、雙鏈DNA損傷等[29]，其中8-OHdG[36]、DNA甲基化結(jié)合蛋白[37]和磷酸化組蛋白H2AX(γH2AX)[38]分別是氧化性DNA損傷、DNA甲基化和雙鏈DNA損傷特異性標(biāo)志物。采用免疫熒光方法，能標(biāo)記特定的DNA損傷標(biāo)志物，并通過HCS高通量來對(duì)化合物DNA損傷類型進(jìn)行判定。Barber[39]和Kim等[40]以抗體標(biāo)記γH2AX，并采用HCS來對(duì)生成的γH2AX foci進(jìn)行定量分析，通過該方法可以對(duì)遺傳毒物的作用機(jī)制有一定了解。

2.1.3 微核試驗(yàn)

微核實(shí)驗(yàn)是在細(xì)胞核水平對(duì)遺傳毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，微核的生成存在2種機(jī)制，一種是由遺傳毒物干擾細(xì)胞分裂器所引起的[41]，這使得生成的絕大部分微核中含有著絲點(diǎn)或著絲粒，這類遺傳毒物被稱為非整倍體斷裂劑，能間接的造成遺傳毒性。另一種微核生成是由高水平的DNA損傷引起的[32]，這種機(jī)制與Cyclin B1濃度含量有關(guān)[42]。微核生成前，細(xì)胞核內(nèi)已發(fā)生嚴(yán)重的基因突變和染色體損傷斷裂，然而過低的Cyclin B1濃度使得紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)(spindle assembly checkpoint, SAC)并不會(huì)被激活，因此DNA嚴(yán)重?fù)p傷的細(xì)胞被迅速退出M期，導(dǎo)致部分脫核的染色體形成微核[42-45]。基于這一機(jī)制生成微核的遺傳毒物被稱為染色體斷裂劑[41]，其能直接的對(duì)DNA造成高水平的損傷。這2種微核生成的機(jī)制是細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。

通過圖像特征提取算法的優(yōu)化，HCS可以自動(dòng)化高通量的定位存在于細(xì)胞質(zhì)中的微核，微核的生成率是遺傳毒性可靠的衡量指標(biāo)。例如，Yan等[46]通過HCS對(duì)9種苯并噻唑類化合物進(jìn)行了遺傳毒性評(píng)價(jià)，其中以4-NQQ和B(α)P為陽(yáng)性對(duì)照，確保了實(shí)驗(yàn)的靈敏度，同時(shí)細(xì)胞急性毒性采用細(xì)胞減少率表示并在實(shí)驗(yàn)中加以控制。在此基礎(chǔ)上對(duì)9種苯并噻唑類暴露MGC803和A549后微核的生成率進(jìn)行衡量，HCS的檢測(cè)結(jié)果表明2-氨基苯并噻唑(ABT)、2-羥基苯并噻唑(OHBT)、2-氯苯并噻唑(CBT)、2-溴苯并噻唑(BrBT)和2-甲硫基苯并噻唑(MTBT)的微核率能夠呈現(xiàn)出劑量響應(yīng)關(guān)系。HCS也能根據(jù)上述2種微核生成機(jī)制，利用微核形態(tài)區(qū)分非整倍體毒劑和染色體斷裂劑。Kiyohiro等[41]發(fā)現(xiàn)通過區(qū)分微核的大小可以和FISH方法一樣有效的區(qū)分非整倍體毒劑和染色體斷裂劑，因?yàn)榉钦扼w毒劑所造成的微核相比于染色體斷裂劑的尺寸更大。Walter等[47]又通過HCS分析，以MMS和紫杉醇為指標(biāo)化合物，確定了不同機(jī)制下產(chǎn)生的2種微核面積區(qū)分閥值，并采用這一閥值去測(cè)定了62種指標(biāo)化合物，該方法不僅檢測(cè)過程更為簡(jiǎn)單快速，且具有較高的靈敏度和特異性。

2.2 器官毒性評(píng)價(jià)

生物在環(huán)境中所暴露的化合物會(huì)對(duì)體內(nèi)特定的器官產(chǎn)生各異的毒性作用，對(duì)化合物展開特定器官毒性評(píng)價(jià)能夠發(fā)現(xiàn)該化合物在體內(nèi)所影響的主要靶器官，部分揭示其所具有的毒性作用機(jī)制。同時(shí)隨著毒理學(xué)研究的進(jìn)步，替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的體外模型研究是發(fā)展主流[2]。利用HCS能夠高通量對(duì)不同器官來源的細(xì)胞系和原代細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)高靈敏的毒性評(píng)價(jià)，從而使器官毒性評(píng)價(jià)的方式從活體實(shí)驗(yàn)向離體實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)變。以肝毒性為例，肝是外源化合物主要的代謝器官，外源化合物進(jìn)入體內(nèi)后首先被哺乳動(dòng)物肝臟中I相和II相代謝酶代謝，盡管對(duì)于大多數(shù)化合物來說，代謝過程是一個(gè)解毒的過程[48]，但有些化合物在代謝后會(huì)產(chǎn)生毒性更強(qiáng)的代謝產(chǎn)物，例如B(α)P[49]。因此在毒理學(xué)中對(duì)化合物肝毒性評(píng)價(jià)是研究的重點(diǎn)，肝損傷的類型包括肝細(xì)胞的壞死、凋亡、致癌作用和氧化應(yīng)激等[48]。HepG2是在離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中評(píng)價(jià)肝毒性常用的細(xì)胞系，屬于人源肝癌上皮細(xì)胞[50]。O'Brien等[51]采用HepG2對(duì)243種來源于藥品的化合物進(jìn)行HCS，以評(píng)估該方法對(duì)肝毒性評(píng)價(jià)的靈敏度和特異性。細(xì)胞采用4種染料分別標(biāo)記了細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、線粒體膜電和細(xì)胞膜通透性和DNA含量，結(jié)果表明，相比另外7種在離體實(shí)驗(yàn)中常用的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)手段，基于HCS肝毒性評(píng)價(jià)方法不僅具有類似的特異性，靈敏度也高達(dá)93%。通過機(jī)器學(xué)習(xí)分析HCS數(shù)據(jù)，Edward等[52]只通過PI和hoechst對(duì)細(xì)胞染色，即根據(jù)細(xì)胞核形態(tài)和細(xì)胞膜完整性這2個(gè)方面的參數(shù)，采用有監(jiān)督的分類方法來自動(dòng)區(qū)分了健康、凋亡和壞死細(xì)胞，從而評(píng)價(jià)了金屬納米材料所能導(dǎo)致的肝毒性。除了HepG2細(xì)胞，其他細(xì)胞系和原代培養(yǎng)細(xì)胞也廣泛的應(yīng)用于化合物肝毒性評(píng)價(jià)。而對(duì)于其他器官毒性的評(píng)價(jià)，如腎[53]和心臟[54]毒性等，HCS也應(yīng)用廣泛。

2.3 神經(jīng)毒性評(píng)價(jià)

神經(jīng)毒性適用于描述毒性化合物對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能造成不良影響的能力[55]。眾多疾病，如阿爾茨海默病[56]，都是由于神經(jīng)系統(tǒng)的損傷而引起的。已有多種環(huán)境污染物被發(fā)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)會(huì)造成損傷，盡管神經(jīng)毒性也是器官毒性的一種表現(xiàn)，但是其毒性指標(biāo)的獲取過程更為復(fù)雜，而采用離體神經(jīng)細(xì)胞結(jié)合HCS來評(píng)價(jià)化合物的神經(jīng)毒性已是一種有效的毒性測(cè)試手段。評(píng)價(jià)的指標(biāo)包括了細(xì)胞毒性、神經(jīng)細(xì)胞間信號(hào)傳遞、神經(jīng)纖維生長(zhǎng)和突觸形成。Joseph等[57]采用來源于人神經(jīng)前體細(xì)胞系ReNcell CX細(xì)胞結(jié)合HCS表明，結(jié)合神經(jīng)細(xì)胞增殖和活力指標(biāo)可以用來評(píng)價(jià)化合物的神經(jīng)毒性。Nicholas等[57]也發(fā)現(xiàn)HCS能高效的提取和分析神經(jīng)突的線性結(jié)構(gòu)，化合物的神經(jīng)毒性大小能以對(duì)神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制的能力和影響細(xì)胞活力的大小來進(jìn)行衡量。隨著HCS圖形分析技術(shù)的提高，更為細(xì)致的神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)能夠被提取和分析。Joshua等[58]確認(rèn)了在正常培養(yǎng)的嚙齒動(dòng)物原代培養(yǎng)的混合皮質(zhì)細(xì)胞中，抗體標(biāo)記的點(diǎn)狀突觸蛋白在樹突處具有更高的密度，表明突觸主要形成于該區(qū)域。而神經(jīng)毒性化合物暴露后可以通過HCS來自動(dòng)的判斷在樹突處突觸的減少量，結(jié)合神經(jīng)細(xì)胞其他的形態(tài)特征，這些參數(shù)能夠有效的來判斷化合物的神經(jīng)毒性。

化合物在完整的生命體中的神經(jīng)毒性作用也能利用HCS進(jìn)行高通量的評(píng)價(jià)。Tara等[59]采用EGFP標(biāo)記斑馬魚，評(píng)價(jià)了斑馬魚胚胎在受精后19 h到29 h內(nèi)會(huì)產(chǎn)生自發(fā)性尾部收縮現(xiàn)象。這種現(xiàn)象被認(rèn)為是斑馬魚胚胎的第一次肌動(dòng)活動(dòng)，潛在的發(fā)育神經(jīng)毒性化合物能夠顯著的干擾該現(xiàn)象的產(chǎn)生。來源于EPA的ToxCast一期化學(xué)品文庫(kù)中的16種化合物在斑馬魚胚胎受精后5 h到25 h內(nèi)進(jìn)行靜態(tài)暴露，再用HCS設(shè)備在隨后大約1.4 h的視頻獲取時(shí)間內(nèi)對(duì)不同化合物暴露濃度下的自發(fā)性尾部收縮現(xiàn)象進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明阿維菌素(abamectin)和埃瑪菌素(emamectin benzoate)的暴露下，斑馬魚胚胎雖然沒有嚴(yán)重的畸形，但完全喪失自發(fā)性尾部收縮能力，從而通過HCS可以間接證明這兩種化合物具有發(fā)育神經(jīng)毒性。

2.4 化合物作用機(jī)制

當(dāng)前，HCS在對(duì)海量化合物作用機(jī)制(mode of action, MoA)的研究已經(jīng)極大的促進(jìn)了藥物篩選的發(fā)展[5]，盡管藥物篩查和生態(tài)毒理學(xué)這2個(gè)領(lǐng)域中對(duì)化合物的毒性測(cè)試的出發(fā)點(diǎn)和目的性都不盡相同，但是藥篩過程中利用HCS展開海量化合物的MoA研究方法對(duì)生態(tài)毒理學(xué)中HCS的應(yīng)用提供了有益的參考。藥物篩查的目的是在藥物研發(fā)的初期，在大型化合物文庫(kù)(chemical library)中尋找針對(duì)特定藥物作用靶點(diǎn)(target)具有生物活性的化合物。而對(duì)于同一靶點(diǎn)有效的化合物也可能會(huì)發(fā)生脫靶效應(yīng)(off-target effect)，即化合物會(huì)同時(shí)對(duì)特定靶點(diǎn)以外的體內(nèi)生物大分子結(jié)合，這可能導(dǎo)致該化合物在藥物開發(fā)后期被發(fā)現(xiàn)具有嚴(yán)重的副作用而造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[60-62]。正因如此在藥物篩查的過程中應(yīng)盡早發(fā)現(xiàn)化合物的脫靶效應(yīng)，所以需要在這一過程中對(duì)化合物的MoA展開研究[63]。盡管生物組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，如基因芯片、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等已能夠有效的尋找化合物的MoA，但是高昂的成本使其難以在大規(guī)模的藥物篩查中展開，而利用HCS對(duì)產(chǎn)生的細(xì)胞多維表型進(jìn)行挖掘，能夠了解化合物的MoA，尋找到目標(biāo)化合物[33]。

藥物篩查過程中，HCS對(duì)MoA的研究主要通過2個(gè)方向來進(jìn)行，一是對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵的蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記，通過對(duì)該蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)位來直接了解暴露化合物的MoA。例如對(duì)于核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)[64-65]，NF-κB的核轉(zhuǎn)位是調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)的一個(gè)重要的分子途徑，也是藥物篩查中一個(gè)重要的靶點(diǎn)。類似的HCS篩查也對(duì)細(xì)胞骨架[66-67]、蛋白酶體[68]和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白[66]等展開。另一個(gè)方向是結(jié)合計(jì)算毒理學(xué)來對(duì)HCS的多維細(xì)胞表型篩選來進(jìn)行化合物MoA的研究。Wawera等[69]認(rèn)為HCS中所得到的表型是一種無偏的，多維度的“通用性語(yǔ)言(univeral language)”，可以最大限度的反應(yīng)生物活性，有利于化合物的MoA研究。Young等[33]在這一個(gè)方向上展開了一些探索性的工作，結(jié)合了HCS的表型分析和配體-預(yù)測(cè)模型來對(duì)化合物的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，結(jié)果揭示HCS所得到的細(xì)胞表型更應(yīng)該去預(yù)測(cè)化合物的作用靶點(diǎn)，而不是去反映化合物的結(jié)構(gòu)特征。得益于生物數(shù)據(jù)的積累和計(jì)算機(jī)水平的進(jìn)步，在此方向上對(duì)化合物的MoA研究能在更大的藥物篩查規(guī)模上進(jìn)行，近些年來已有眾多的MoA分析方法被建立和應(yīng)用[63,69]。

2.5 RNA干擾和cDNA過表達(dá)

RNA干擾[70]和cDNA過表達(dá)[71]技術(shù)的應(yīng)用使我們得以以“l(fā)oss of fuction”和“gain of function”的遺傳學(xué)手段來研究化合物的MoA，在藥理學(xué)領(lǐng)域提出了化學(xué)遺傳學(xué)(chemical genetic)的概念[72]，其目的是對(duì)化合物庫(kù)中的小分子化合物進(jìn)行篩查來研究這些化合物對(duì)生物大分子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，也是為了發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點(diǎn)。HCS能夠同時(shí)對(duì)基因表達(dá)變化和化合物處理所引起的細(xì)胞表型的微小改變做出響應(yīng)，化學(xué)遺傳學(xué)中通常采用RNA干擾文庫(kù)和化合物文庫(kù)并行HCS(parallel HCS)[66,73]，來探索兩者細(xì)胞表型之間的關(guān)系。兩種文庫(kù)中篩選產(chǎn)生的細(xì)胞表型首先被聚類，在同一個(gè)聚類類別中，篩選出的化合物可能和這個(gè)類別下所沉默的基因?qū)е孪嗤谋硇停虼丝梢哉J(rèn)為這些化合物能夠干擾該沉默基因原本的表達(dá)，從而找到潛在的藥物靶標(biāo)和生物標(biāo)記物。

在生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域，更多的應(yīng)用是通過RNA干擾和cDNA過表達(dá)技術(shù)來構(gòu)建基因低表達(dá)和過表達(dá)系統(tǒng)，HCS也能靈敏的檢測(cè)到構(gòu)建前后的表型差異。例如，盡管HepG2細(xì)胞被廣泛的應(yīng)用于肝毒性檢測(cè)，但是多種CYPs在這種細(xì)胞模型中表達(dá)量較低[74]，不利于模擬體內(nèi)肝臟的代謝功能， Tolosa等[75]利用cDNA過表達(dá)技術(shù)在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)多個(gè)CYPs，該細(xì)胞模型與原代肝細(xì)胞中CYPs表達(dá)量相類似，因此顯著提高了HCS對(duì)肝毒性檢測(cè)的靈敏度。

3 展 望

當(dāng)前HCS已發(fā)展到一個(gè)新的階段，性能日益強(qiáng)大的設(shè)備拓展了HCS在生態(tài)毒理學(xué)的應(yīng)用，但HCS并不僅僅依賴于設(shè)備本身，更需要利用海量數(shù)據(jù)去回答亟待解決的生物學(xué)問題，因此數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)挖掘已成為了HCS應(yīng)用所要著力加強(qiáng)的地方。

在面對(duì)從活體向離體毒性實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)換的過程中出現(xiàn)的新問題，一些新的生物學(xué)技術(shù)也應(yīng)當(dāng)在HCS中得到進(jìn)一步的應(yīng)用。例如三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，因?yàn)楸M管單層細(xì)胞培養(yǎng)具有眾多優(yōu)點(diǎn)，但是單層細(xì)胞不能很好的模擬細(xì)胞在體內(nèi)真實(shí)的生理狀態(tài)，缺乏細(xì)胞間通訊機(jī)制，培養(yǎng)周期短且只適合單種細(xì)胞類型細(xì)胞培養(yǎng)[76]。在藥物毒理學(xué)領(lǐng)域，已有多項(xiàng)證據(jù)表明了這種差異性對(duì)特定器官毒性評(píng)價(jià)時(shí)會(huì)產(chǎn)生不利影響[77]。例如曲伐沙星(trovafloxacin)在臨床使用過程中首先被發(fā)現(xiàn)有很強(qiáng)的肝毒性[78]，而在對(duì)人源肝細(xì)胞(hepatocyte)藥物篩查期間并沒有明顯的毒性作用[79]，最近的研究表明，可能是體內(nèi)肝臟細(xì)胞與單層細(xì)胞培養(yǎng)模型間的差異造成的[80]。而三維細(xì)胞培養(yǎng)模型[81]能夠部分彌補(bǔ)單層細(xì)胞培養(yǎng)模型的不足，模擬更真實(shí)的體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境。得益于HCS設(shè)備性能的提高，利用HCS基于三維培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)化合物進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)也展開了探索性的研究[82]

HCS在生態(tài)毒理學(xué)的應(yīng)用仍然需要結(jié)合其他學(xué)科的發(fā)展，例如結(jié)合生物組學(xué)和計(jì)算毒理學(xué)的相關(guān)應(yīng)用，來研究海量化合物的毒性作用機(jī)制。因?yàn)樵诋?dāng)前化合物的毒性評(píng)價(jià)中，對(duì)其毒性作用機(jī)制的研究已越來越為重要，作用機(jī)制的研究能夠提供從化合物暴露到毒性效應(yīng)之間一系列有證據(jù)支持的、具有因果關(guān)系的關(guān)鍵事件(key events)，從而提高評(píng)價(jià)效率，減少由毒性資料外推到人的不確定因素[4,83]，來更好的對(duì)化合物的生產(chǎn)和使用展開監(jiān)管。

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◆

Principles and Applications of High Content Screening Technology in Ecotoxicology

Huang Chao, Yan Ye, Li Na, Ma Mei*, Wang Zijian

Key Laboratory of Drinking Water Science and Technology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China

15 November 2014 accepted 7 January 2015

As a large amount of environmental pollutants may pose hazardous effects on the environment and human beings at low concentrations, evaluating the toxic effects of these chemicals and understanding their mechanisms of action (MOA) are essential for management of chemical environmental risks. Therefore, high-throughputinvitrobioassay methods have been rapidly developed to satisfy the toxicity assessment of countless chemicals. High-content screening (HCS), as a new cell-based screening approach, allows multi-endpoint determination simultaneously in intact cells. This review introduced the principles of HCS and summarized its application in ecotoxicology. Finally, the new developments and challenges of HCS are proposed.

high-content screening; high-throughput screening; in vitro bioassay; ecotoxicology

自然科學(xué)基金重點(diǎn)課題(No. 51290283)；自然科學(xué)基金重點(diǎn)基金(No. 21437006)

黃超(1989-)，男，碩士生，研究方向?yàn)樗鷳B(tài)毒理學(xué)，E-mail: hch-app@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: mamei@rcees.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20141115001

2014-11-15 錄用日期：2015-1-7

1673-5897(2015)2-2-11

X171.5

A

馬梅(1967-)，女，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事水生態(tài)毒理學(xué)研究。

黃超, 言野, 李娜, 等. 高內(nèi)涵篩選技術(shù)的原理及其在生態(tài)毒理學(xué)的應(yīng)用[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2015, 10(2): 2-12

Huang C, Yan Y, Li N, et al. Principles and applications of high content screening technology in ecotoxicology [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 2-12 (in Chinese)