家蠶
——新的內分泌干擾物篩選靶標

沈衛(wèi)鋒，孟智啟，蔡磊明

1．浙江省農業(yè)科學院蠶桑研究所，杭州 310021 2．浙江省農業(yè)科學院農產品質量標準研究所，杭州 310021

家蠶
——新的內分泌干擾物篩選靶標

沈衛(wèi)鋒1，孟智啟1，蔡磊明2,*

1．浙江省農業(yè)科學院蠶桑研究所，杭州 310021 2．浙江省農業(yè)科學院農產品質量標準研究所，杭州 310021

內分泌干擾物對人類及環(huán)境的影響日益嚴重，如何建立快速有效的篩選方法，從復雜的周圍環(huán)境中鑒別出具有內分泌干擾活性的物質，指導人們盡量規(guī)避不必要的暴露風險，成了當前環(huán)境學家的重要任務。本文以鱗翅目昆蟲的模式物種家蠶為對象，介紹了其內分泌系統(tǒng)組成及相關激素的作用，分析了作為內分泌干擾物篩選靶標的優(yōu)勢，闡述了候選的測試端點及依據，從理論和方法不同角度探討了家蠶成為一種新的內分泌干擾物篩選靶標的可行性。

內分泌干擾物；家蠶；篩選靶標

內分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals, EDCs)是一類廣泛存在于環(huán)境、食物以及消費品中的可以對生物體內激素水平產生影響的物質。如何快速、有效地從成千上萬的可疑物質中篩選出對生物體內分泌系統(tǒng)確實具有干擾作用的化學物質已成為生態(tài)毒理學、環(huán)境科學等研究領域的當務之急。

對于內分泌干擾物篩選靶標動物的選擇，要遵循以下原則：①實驗動物易于獲得并易于在實驗室培養(yǎng)；②實驗動物生長迅速，生活周期短；③實驗動物的基礎生物學研究比較深入，前期研究實驗數據較豐富；④實驗動物具有完備的內分泌系統(tǒng)，其生長、發(fā)育、繁殖均受激素調控[1]。目前常用的內分泌干擾物篩選動物靶標有：嚙齒類(大、小鼠)、魚類(黑頭呆魚、日本青鳉)、兩棲類(非洲爪蟾)等。昆蟲是動物界中最大的一個類群，是無脊椎動物門的代表，無論從個體數量、生物數量、種類與基因數來講，都在生物界中占有十分重要的地位。鱗翅目是昆蟲綱中的第二大目，其中家蠶(Bombyx mori)作為鱗翅目昆蟲的模式物質，是我國特有的經濟昆蟲，有著五千多年的飼養(yǎng)歷史。家蠶能否被開發(fā)成一種全新的內分泌干擾物篩選靶標動物，將在下文中進行詳細探討。

1 家蠶的內分泌系統(tǒng)

1.1 內分泌系統(tǒng)組成

家蠶的內分泌腺體包括腦神經分泌細胞、咽下神經節(jié)、前胸腺、咽側體和胸腹部神經節(jié)分泌細胞，主要分泌腦激素、滯育激素、蛻皮激素、保幼激素等。它們通過各自靶器官與家蠶的生長發(fā)育、生殖、代謝等生命活動密切相關，組成一個完整的內分泌系統(tǒng)(圖1)[2]。

圖1 家蠶內分泌腺體及其相互作用[2]Fig. 1 Endocrine glands and interactions of silkworm[2]

1.1.1 保幼激素(juvenile hormone, JH)

家蠶的保幼激素是由咽側體糙面內質網合成的一類具有環(huán)氧基結構的激素，目前已知有3種結構類似物，分別為：JH-I、JH-II、JH-III，后兩種為鱗翅目昆蟲特有。JH具有保持家蠶幼蟲形態(tài)，阻止成蟲器官芽發(fā)育的作用。當JH分泌量少或停止分泌時，脂肪體內大量積累蛋白質，絲腺迅速生長，當蠶體內沒有JH存在的情況下卵巢才能迅速長大[3-4]。可見，JH能促進DNA合成，相反抑制了RNA和蛋白質的合成。

1.1.2 蛻皮激素

家蠶的蛻皮激素(molting hormone, MH)是由前胸腺合成的一類甾體化合物，目前已知有2種：α-MH、β-MH，其分泌受腦激素的控制，腦激素分泌前，前胸腺無分泌活性。家蠶MH的功能如下：第一，激發(fā)新表皮形成和舊表皮脫下；第二，促進RNA和蛋白質的合成，其中包括與生殖發(fā)育相關的卵黃原蛋白；第三，增強細胞的呼吸作用，使得線粒體數量和體積增加[2-4]。

1.1.3 滯育激素

家蠶的滯育激素(diapause hormone, DH)是由咽下神經節(jié)分泌的一類多肽激素，由15種氨基酸組成，目前已知有2種：DH-A、DH-B。家蠶DH的功能是控制蠶卵的滯育特性，提高卵巢膜和卵膜的透性，影響卵內糖、脂質和蛋白質的代謝方向等[5-6]。

1.1.4 腦激素

家蠶腦激素的種類比較多，包括：促前胸腺激素(pmthoracicotropic hormone, PTTH)、鞣化激素、羽化激素、利尿激素等。PTTH是一種神經多肽物質，氨基酸序列與人胰島素具有同源性，其中與胰島素A鏈的1-20位和類胰島素生長因子Ⅰ的42-60位相同[7]，其作用是活化前胸腺，使其產生MH，同時抑制咽側體活性；鞣化激素能使幼蟲腹部表皮鞣化、著色；羽化激素在從蛹到蛾的發(fā)育過程中產生，并在羽化前約40 min釋放到家蠶血液中，控制蛹的羽化行為；利尿激素的作用是促進馬氏管從血液中吸取水分，以保持正常的血液滲透壓[2]。

1.2 內分泌激素對生理的調節(jié)

1.2.1 對生長發(fā)育的調節(jié)

在家蠶的生長發(fā)育過程中，JH、MH、腦激素的分泌活性呈現周期性交替變化。從蟻蠶開始，各齡前期咽側體分泌JH旺盛，促進了體細胞的迅速增大；各齡中期腦激素短暫分泌，活化了前胸腺分泌MH，同時抑制了JH，促使細胞充實、分裂和分化，達到一定程度后即可誘導幼蟲蛻皮。如此反復循環(huán)，經歷4次蛻皮，幼蟲顯著長大(圖2)[2-3]。由此可見，JH對幼蟲的生長起主導作用，MH對幼蟲的發(fā)育起主導作用，兩者均受腦激素的調控。

圖2 保幼激素(JH)和蛻皮激素(MH)分泌相[2-3]Fig. 2 Secretory profile of juvenile hormone (JH) and molting hormone (MH)[2-3]

1.2.2 對生殖的調節(jié)

家蠶卵巢的生長及卵的發(fā)育、成熟主要在蛹期完成，因此成蟲在羽化后不需要取食即可進行交配。一般認為，JH與卵的成熟發(fā)育相關，對增加產卵量有一定的作用，但對精母細胞的成熟分裂和精子的形成有抑制作用；MH則能促進卵巢發(fā)育、卵黃蛋白的合成，同時也是精子形成的必要條件。

1.2.3 對蠶卵滯育的調節(jié)

家蠶是以卵滯育的昆蟲，咽下神經節(jié)所分泌的DH是調控蠶卵滯育的主要激素。DH通過對碳水化合物、蛋白質、脂質、色素等物質代謝的調節(jié)，從而引發(fā)蠶卵的滯育特性[6]。蠶卵的滯育是當其在卵巢內發(fā)育時就已決定，而非在卵產下后。

1.2.4 對絲腺蛋白生長的調節(jié)

當幼蟲體內存在大量JH時，促進DNA合成；當MH起主導作用時，促進RNA的合成，使絲腺組織迅速增大，大量蛋白質充滿絲腺腔體，隨后老熟幼蟲吐絲化蛹[4,8]。化蛹后咽側體不分泌JH，絲腺組織最終被解離。

1.3 控制激素的基因

關于家蠶體內與激素分泌相關基因的研究不多，主要有：性成熟基因Lm(遲熟)、Lme(早熟)；眠性基因M3(3眠)、+M(4眠)、M5(5眠)；化性基因V3(多化)、+V(2化)、V1(1化)。

2 家蠶作為內分泌干擾物篩選靶標的優(yōu)勢

2.1 實驗動物易于獲得并易于在實驗室培養(yǎng)

眾所周知，家蠶在我國有著悠久的飼養(yǎng)歷史，也是目前飼養(yǎng)規(guī)模最大的昆蟲。傳統(tǒng)家蠶飼養(yǎng)因飼養(yǎng)地的氣候限制，每年大多1～3代，兩廣等熱帶地區(qū)可達5～6代。為了解決氣候條件對飼養(yǎng)的限制，20世紀60年代，日本蠶學家進行家蠶全齡人工飼料育試驗探索并獲得了成功[9]。我國從70年代起開展了家蠶人工飼料研究，近40年不間斷地研究積累了豐富的實驗資料與飼育經驗[10-11]，培育了一批人工飼料適食性較好的家蠶品種，能夠為篩選試驗全年無休地提供充足的材料蠶，完全符合實驗動物易于培養(yǎng)獲得的要求。

2.2 實驗動物生長迅速，生活周期短

家蠶是完全變態(tài)的昆蟲，其一生要經過卵、幼蟲、蛹、成蟲4個形態(tài)和機能上完全不同的發(fā)育階段。從蟻蠶孵化到成蟲產下卵，整個過程大約只需經歷40～45 d。而目前常用的內分泌干擾物篩選靶標動物中，大鼠(Rattus norvegicus)需要6～8周達性成熟，3個月達體成熟，壽命長達在3～5 a；黑頭呆魚(Pimephales promelas)需要飼養(yǎng)4.5～6個月才能作為篩選試材；非洲爪蟾(Xenopus laevis)在室內養(yǎng)殖條件下1～2 a才能達到性成熟，平均壽命更是長達5～15 a。因此，從動物個體的生長速度、生命周期而言，家蠶無疑具有成為新篩選靶標的巨大潛力。

2.3 實驗動物的基礎生物學研究比較深入，前期研究實驗數據較豐富

從人類開始飼養(yǎng)家蠶以來，蠶學就被當成一門學科來研究，內容包括：蠶體解剖生理學、遺傳學、育種學、病理學、蠶絲生物學等，非常詳實地記錄了家蠶的分類、形態(tài)結構、生活習性、繁殖特征、遺傳發(fā)育，以及其他有關的生命活動特征和規(guī)律。家蠶在生長發(fā)育過程中，其形態(tài)改變所對應的生理生化變化、器官發(fā)育與消解、激素水平變化等相關內容都有詳細的研究。近年來，隨著全基因測序及精細物理圖譜繪制工作的完成[12-13]，為蠶學這一古老的學科增添了新鮮血液，開啟了人類從分子水平重新去研究家蠶的序幕。

2.4 實驗動物具有完備的內分泌系統(tǒng)，其生長、發(fā)育、繁殖均受激素調控

和哺乳類(大、小鼠)、非哺乳類(如兩棲類、魚類)動物一樣，家蠶也具有一套完整的內分泌系統(tǒng)。其內分泌腺體所分泌的多種激素，經血液運輸至蠶體各部位，從而調控家蠶的一切生長、發(fā)育及生殖過程，包括：蟻蠶的孵化，幼蟲的生長與蛻皮，老熟幼蟲的吐絲結繭與化蛹，成蟲的羽化、交配與產卵等行為。因此，家蠶具備了成為內分泌干擾物篩選靶標的基本條件。

3 以家蠶為靶標的測試端點篩選

根據家蠶體內各種激素對其生長、發(fā)育、生殖調控的機理，以下一些指標可作為測試端點的候選。

3.1 對各齡幼蟲入眠、眠起時間的影響

JH與MH量的動態(tài)平衡控制了幼蟲每一齡期所需要的時間。對于特定的家蠶品種，眠性由遺傳因素決定，同時受到外界環(huán)境的影響。如果外源化合物干擾家蠶的內分泌系統(tǒng)，打破了JH與MH的平衡，勢必會引起入眠、眠起時間的變化。因此，入眠和眠起時間可作為候選的測試端點。

3.2 對蟲體色、成蟲羽化能力、蠶卵滯育及化性的影響

JH能影響黑色素前驅物酪氨酸向外胚層組織轉移，阻礙黑色素形成；羽化激素在成蟲發(fā)育完成后被釋放到血液中，一旦出現異常會造成羽化障礙；DH控制了卵的滯育特性，使家蠶需經過低溫和時間的積累才可孵化。因此，可以觀察外源化合物對這些指標的影響，分析作為測試端點的可能性。

3.3 對絲腺發(fā)育及全繭量、繭層量的影響

有研究表明，外源化合物會造成絲腺發(fā)育異常，影響全繭量、繭層量等繭絲指標。如，咪唑類化合物是保幼激素抑制劑，處理不同齡期的幼蟲后，全繭量的變化范圍為：62%～104%，繭層量為：56%～106%[2]。可見，絲腺發(fā)育指標可以作為候選的測試端點。

3.4 對生殖器官及生殖能力的影響

實驗證明，雌蛾的產卵能力及卵的孵化能力受到腦、咽側體、前胸腺所分泌激素的聯(lián)合調控。一旦外源化合物侵入蠶體破壞各種激素的正常代謝，就會影響卵巢和精巢的組織特征以及成蟲的繁殖能力。因此，雌蛾產卵能力、卵孵化率、后代性比等指標也可以作為測試端點的候選。

3.5 對幼蟲血液組織基因表達、蛋白表達、物質代謝的影響

有研究表明，由腦合成的PTTH促進了前胸腺合成和釋放蛻皮激素前體，在血液中轉變成20-OH蛻皮酮(MH)，啟動一系列基因表達，調控幼蟲蛻皮、羽化等級聯(lián)反應，最終完成啟動蛻皮、蛻皮、蛻皮后體壁鞣化等生理過程[2]。如果外源化合物與幼蟲血液中的激素受體結合，一定會干擾正常的基因表達、蛋白合成，以及體內各類物質的代謝，通過對這些變化的分析，或許也可以找到相關的測試端點。

外源化合物在干擾機體內分泌系統(tǒng)的同時也引起了其它生理、生化、細胞等改變，測試端點的變化可能只是機體的一種暫時反應，也可能很多化學物質都會引起類似的變化，因此測試端點的特異性就顯得尤為重要。很多研究者從試驗現象出發(fā)所提出的測試端點往往在特異性方面有所欠缺，所以必須通過反復試驗來確認其可靠性。另一方面，加強內分泌干擾機制研究也將為測試端點的確認提供理論依據。

4 小結與展望

昆蟲屬于節(jié)肢動物門，是無脊椎動物中最重要的一類，也是地球上數量最多的動物群體，是動物向魚類、鳥類、哺乳類等更高級的脊椎動物模式進化的必經階段。因此，研究外源化合物對昆蟲的影響，是全面評價該物質對動物體影響的重要方面，是對脊椎動物評價結果的有力補充。目前現有的一些脊椎動物靶標，有的個體較大(大鼠)，對于外源化合物的耐受能力相對較強，低劑量的內分泌干擾效應不容易被發(fā)現；有的飼養(yǎng)周期太長(非洲爪蟾)，不太適合用作內分泌干擾累代效應的評價。家蠶由于長期以來的隔絕飼養(yǎng)，是一種對外源化合物很敏感的昆蟲，再加上個體較小、生長周期短、易于獲得的特性，非常適合用作外源化合物對動物體影響評價的靶標。袁紅霞[14]評價了4-壬基苯酚對家蠶生殖系統(tǒng)的影響，通過調查性腺指數、產卵能力、子代孵化率、性腺的組織病理以及生殖發(fā)育關鍵基因的變化，篩選了可用于生殖毒性評價的生物標志物。但是，家蠶作為昆蟲與哺乳動物在進化程度上有較大差異，如何將家蠶的內分泌干擾效應借鑒到哺乳動物甚至人類，還有待進一步的研究。

據估計，農藥品種中大約70%～80%可能是內分泌干擾物。1999年世界自然基金會《環(huán)境中被報告具有生殖和內分泌干擾作用的化學物質清單》中共列舉了125種環(huán)境內分泌干擾類物質，其中農藥86種，占68.8%。截至2008年，報道的具有內分泌干擾效應的農藥已達127種，農藥對于環(huán)境、動物、人類直接以及潛在的危害，越來越受到人們關注。因此，建立一種快速、準確、有效的內分泌干擾效應評價體系迫在眉睫。基于上述特性，在農藥類內分泌干擾物篩選評價領域，家蠶非常有希望成為優(yōu)良的動物靶標。

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Silkworm—A New Target for Endocrine Disrupting Chemicals Screening

Shen Weifeng1, Meng Zhiqi1, Cai Leiming2,*

1. Sericultural Research Institute, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China 2. Institute of Quality and Standard for Agro-products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China

8 May 2014 accepted 10 July 2014

The influence of endocrine disrupting-chemicals (EDCs) on human and environment is becoming more and more serious. The challenging tasks for environmental experts are establishing an efficient and rapid screening method to identify the active EDCs from complex environment，and guiding people to avoid unnecessary exposure risk. The article introduces the composition of endocrine system and their associated hormones of silkworm (bombyx mori). The advantages of silkworm as an ideal candidate for testing EDCs and candidate measurement endpoints are detailed analysis. The feasibility of silkworm as a new EDC test species are also discussed from the perspective of theory and methods.

endocrine disrupting chemicals; silkworm (bombyx mori); screening target

浙江省重點科技創(chuàng)新團隊項目(2011R50028-4)；農業(yè)部農藥殘留檢測重點實驗室項目(2013PRG03)

沈衛(wèi)鋒(1977-)，男，博士，研究方向為家蠶分子毒理學，E-mail: weifsh@126.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: cailm@zaas.org

10.7524/AJE.1673-5897.20140508002

2014-05-08 錄用日期：2014-07-10

1673-5897(2015)2-154-05

X171.5

A

蔡磊明(1962—)，男，理學博士，教授級高級工程師，主要從事農藥、醫(yī)藥和精細化學品環(huán)境歸宿、生物降解、殘留、環(huán)境毒理學和環(huán)境風險評估等研究。

沈衛(wèi)鋒, 孟智啟, 蔡磊明. 家蠶——新的內分泌干擾物篩選靶標[J]. 生態(tài)毒理學報, 2015, 10(2): 154-158

Shen W F, Meng Z Q, Cai L M. Silkworm-A new target for endocrine disrupting chemicals screening [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 154-158 (in Chinese)