苯并噻唑類污染物對青海弧菌Q67毒性效應

李曉，李娜，饒凱鋒，馬梅，王子健

中國科學院生態環境研究中心 中國科學院飲用水科學與技術重點實驗室，北京 100085

苯并噻唑類污染物對青海弧菌Q67毒性效應

李曉，李娜，饒凱鋒，馬梅*，王子健

中國科學院生態環境研究中心 中國科學院飲用水科學與技術重點實驗室，北京 100085

以青海弧菌Q67為指示生物，結合96微孔板高通量檢測技術，測定了10種環境中常見苯并噻唑類污染物對發光菌的毒性效應。結果表明，10種苯并噻唑化合物均對發光菌具有毒性效應，其EC50在1.17×10-6～5.43×10-3mol·L-1之間。對其進行毒性效應排序，發現巰基取代>氨基>2羥苯基>羧酸乙酯>溴>氟>甲基>氯>甲硫基>苯并噻唑。利用結構化學描述符和偏最小二乘法，構建了苯并噻唑類化合物對Q67發光菌毒性的定量構效關系模型(QSAR)，結果發現，氫鍵供體數量(ND)和極性溶劑可及分子表面積(PSASA)對其毒性具有重要意義。本研究為苯并噻唑類污染物毒性效應評價及其環境風險評價提供了參考。

苯并噻唑；青海弧菌Q67；急性毒性；QSAR

苯并噻唑(BT)類化合物是一類近年來高產量化合物，廣泛應用于工業生產和日常生活中的各個領域。如被用作輪胎和橡膠的添加劑[1-2]，皮革和造紙業的殺菌劑[3]，金屬行業的防腐劑[4]，和醫藥行業抗腫瘤劑[5]等，也可成為化工行業的中間體[2-3,6]。大多BT類化合物易溶于水，這類化合物由于被大量生產和使用，導致其在環境中廣泛存在，并在工業、生活和市政污水中均有檢出[7-10]。目前僅有少量研究報道了BT類物質的毒性，例如BT，2-氨基苯并噻唑(ABT)，2-甲硫基苯并噻唑(MTBT)被報道能夠引起DNA損傷效應[11]；2-巰基苯并噻唑(MBT)被確定為大鼠誘變劑[12]；研究證實BT類物質能增加膀胱癌和腸道癌的風險[1,13-14]；也可對多種上皮細胞產生急性毒性[15]。目前，我國關于苯并噻唑類對于水生態環境污染的研究仍然較少，考慮到它們廣泛的存在，因此對于它們毒性的篩查與評價就顯得較為重要。

發光細菌毒性檢測作為一種操作簡單、反應快速[16]、靈敏度高的方法，已被廣泛應用于環境污染物急性毒性的研究。本研究選用朱文杰等[17]分離得到的一種淡水發光菌——青海弧菌Q67(Vibrio qinghaiensis sp. -Q67)為指示生物，來檢測污染物的毒性。該菌具有獨特的生理特性，在淡水體系中能正常發光，不需要添加大量的氯化鈉，可直接應用于淡水環境樣品的生物毒性測試[18]。國內許多研究者應用該菌種建立了新型發光菌毒性測定方法，已成功用于環境污染監測[19-25]。

定量構效關系模型QSARs(quantitative structure activity relationships, QSARs)，通過建立化合物的生物活性與結構或理化參數之間的定量關系，來探求化合物的生物活性[26]。既有助于預測類似化合物的生物活性，也有助于對化合物的作用機制進行解釋，已被廣泛用于化合物生物活性的預測和評價[27-29]。QSARs在環境科學和毒理學領域的應用也愈加廣泛[30]，為污染物的毒性預測、機制研究和風險評價提供支持。本研究選取10種常見苯并噻唑類化合物作為研究對象，結合96微孔板高通量檢測技術，測定了苯并噻唑類化合物對青海弧菌Q67的半數效應濃度值EC50，采用偏最小二乘法結合結構化學分子描述符構建QSAR預測模型，并對其可能的毒性機制進行解釋。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要儀器和試劑

儀器：高壓滅菌鍋(Sanyo公司)、恒溫振蕩搖床(HZQ-F，哈東聯)、百級超凈工作臺(DL-CJ-1F，哈東聯)、Infinite M200酶標儀(TECAN)、控溫離心機(BECKMANJS-21，德國)、恒溫平板搖床(Titramax 1000，Heidolph，德國)、旋渦混合器(MS2，廣州IKAWorks)等。

試劑：10種苯并噻唑類化合物均購自百靈威公司，化合物的純度見表1。

1.2 實驗菌種

選用青海弧菌Q67(Vibrio qinghaiensis sp. Nov.)為毒性指示生物,由中國科學院生態環境研究中心提供。培養條件參照馬梅等[19]的方法進行。

1.3 苯并噻唑類污染物對Q67發光菌的急性毒性測試

針對目前以上污染物進行毒性研究少見報道的實際情況，結合張輝等[24]96微孔板毒性測試方法，青海弧菌Q67為檢測生物，以環境中檢出率高、備受關注的10種常見苯并噻唑類化合物為研究對象，進行毒性測試。苯并噻唑類污染物對Q67發光菌的急性毒性測試參照文獻[19-20,24-25]實驗方法進行。將各物質配成系列濃度梯度，設空白對照，每個濃度設置3個平行，分別取對照溶液與測試液20 μL于微孔板中，再加入180 μL復活菌液，反應15 min后用酶標儀測定各孔的發光強度(RLU)。以空白對照的RLU的均值(I0)和各濃度的3個平行樣的RLU的均值(I)計算樣品對發光菌發光的相對抑制率X(%)，每塊板重復3次以提高測定精度減少隨機誤差。其中，X(%)=(1-I/I0)×100%

2 結果(Results)

2.1 10種苯并噻唑類化合物對Q67發光菌的急性毒性

通過測定10種苯并噻唑類化合物對Q67發光菌的發光相對抑制率，用OriginPro 8擬合，這類物質對Q67發光菌的急性毒性均呈現明顯的劑量效應關系，并且能很好的擬合(見圖1)。依據擬合的劑量-效應曲線，可以得到10種苯并噻唑類化合物的EC50、EC20以及相關系數(r)，結果見表1。從表1中可以看出，苯并噻唑類化合物的EC50在1.17×10-6～5.43×10-3mol·L-1之間；從圖1中可以看出，本文研究的苯并噻唑對于Q67發光菌的毒性抑制最小，其次是2-甲硫基苯并噻唑，最大是2-巰基苯并噻唑，這與Reemtsma等[3]研究的BT、MTBT和MBT對于費氏弧菌(Vibio fishcheri)的急性水生毒性結果相一致。

圖1 10種苯并噻唑類化合物的劑量-效應曲線Fig. 1 Dose-response curves for 10 benzothiazole and benzothiazole derivatives

表1 10種苯并噻唑類化合物的logistic函數擬合結果Table 1 Fitting results of logistic functions for 10 benzothiazole and benzothiazole derivatives

2.2 10種類化合物對Q67發光菌毒性的QSAR研究

采用軟件MarvinSketch5.8[31]，計算苯并噻唑類化合物的分子描述符。所計算的分子描述符包括具體計算的參數包括分子體積(V)、最高占有軌道能量(HOMO)、最低空軌道能量(LUMO)、偶極矩(μ)和分子平均極化率(α)、正辛醇/水分配系數(logD)、氫鍵受體個數(NA)、氫鍵供體個數(ND)、極性表面積分率、極性溶劑可及分子表面積(PSASA)、分子量(Mw)等。運用軟件SIMCA-P 6.0中的PLS創建模型[32]，主成分分析結果如表2。擬合得到-lgEC50與量化參數的相關方程，最優模型如下：

-logEC50=1.76+1.25ND+0.02PSASA

ND極指氫鍵供體數量，PSASA指極性溶劑可及分子表面積。

圖2 10種-logEC50的實測值與預測值的擬合圖Fig. 2 Plot of observed against predicted -logEC50 values for 10 benzothiazole and benzothiazole derivatives

表2 變量在QSAR模型中的VIP及PLS權重Table 2 VIP and PLS weights of variable for QSAR model

注：“W*1”為權重；“VIP”為投影性指標。

Note: W*1, PLS weights; VIP, values of the variable importance in the projection.

3 討論(Discussion)

本文對苯并噻唑類污染物的致發光菌發光抑制的研究表明，10種苯并噻唑化合物對發光菌的毒性效應的EC50在1.17×10-6～5.43×10-3mol·L-1之間。本文研究的化合物均含有相同的苯并噻唑環母體結構，僅取代基類型不同，對目標化合物進行毒性效應排序，發現巰基取代>氨基>2羥苯基>羧酸乙酯>溴>氟>甲基>氯>甲硫基>苯并噻唑。將理化意義明確的化學結構參數進定量構效關系建模研究(QSARs)，可以進一步從理論上探討化合物的毒性機制，并定量研究化合物的結構與毒性間的關系，是進行生態風險評價的重要手段[30]。本研究利用偏最小二乘法和結構化學描述符，構建了苯并噻唑類化合物對Q67發光菌毒性的預測模型，結果發現，氫鍵供體個數(ND)和極性溶劑可及分子表面積(PSASA)和對其毒性具有重要意義(表2)。在表2中，ND和PSASA顯示出十分接近的VIP及PLS權重，說明2種結構參數在所建的QSARs模型中具有同樣重要的作用，這2種結構參數可以共同解釋苯并噻唑類化合物對發光菌毒性的作用機制。本文的研究結果與蘇麗敏等[22]的研究結果比較相近。

氫鍵供體(ND)反映化合物分子同其它基團形成氫鍵時所能給出的質子氫的個數，氫鍵結合是毒物與受體之間的主要作用方式之一[33-34]。在發光菌體內，化合物的毒性作用是通過毒物分子活性中心與發光菌中螢光素酶這一靶分子相互作用而產生的，黃素單核苷酸作為重要的輔酶[35]，容易與其它分子或基團形成氫鍵。許多研究證明，化合物的ND數量越多，與發光菌受體中的-OH、-NH或=O、O-等越易于形成氫鍵而增強化合物的毒性[25,36]。本文所研究的化合物的取代基中，氨基(-NH2)、羥基(-OH)和巰基(-SH)等基團都易與黃素單核苷酸結合形成氫鍵，則會阻礙或阻止黃素單核苷酸在氧化和還原形式之間的氫傳遞，使得該輔酶的活性受到抑制，從而使發光菌的發光受到抑制。所構建的QSAR模型也證明，隨著ND數量的增加，苯并噻唑類化合物對發光菌的毒性作用增強。

極性溶劑可及分子表面積(PSASA)與分子的大小和形狀有關，指極性溶劑體系下可以到達的化合物的表面積。所構建的QSAR模型證明PSASA數值越大，苯并噻唑類化合物對發光菌的毒性越高。PSASA在QSAR研究中，表示為空間分子結構描述符參數，由于10種苯并噻唑類化合物的取代基類型不同，其形狀和大小產生了不同的立體效應，從而影響污染物與菌體內的靶蛋白的接觸面積和接觸幾率。PSASA數值越大，污染物與靶位點作用的強度和概率越高，從而顯示出更強的毒性效應。

綜上所述，本研究所檢測的10種苯并噻唑類化合物均對Q67發光菌具有毒性作用。利用偏最小二乘方法構建的QSAR模型預測能力較好、穩定性較高，能用來預測其他苯并噻唑類污染物對Q67發光菌的毒性效應。在所選擇的結構變量中，氫鍵供體數量和極性溶劑可及分子表面積對其毒性具有重要意義。

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◆

Toxicities of Benzothiazole and Benzothiazole Derivatives (BTs) toVibrioqinghaiensissp. -Q67

Li Xiao, Li Na, Rao Kaifeng, Ma Mei*, Wang Zijian

Key Laboratory of Drinking Water Science and Technology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China

24 November 2014 accepted 18 December 2014

The acute toxicities of benzothiazole and benzothiazole derivatives (BTs) to Vibrio qinghaiensis sp. -Q67 were tested using 96-well microplate high-throughout method. The results showed that the EC50s of BTs ranged from 1.17×10-6to 5.43×10-3mol·L-1. Among the substituent groups of BTs, mercapto> amino> 2-hydroxyphenyl> nonanoic acid-ethyl ester > bromo> fluorobenzene> methyl > chlororine > methylthio> benzothiazole. Molecular descriptors and partial least squares regression were used to establish quantitative structure-activity relationship (QSAR). The results showed that the number of hydrogen bond donor (ND) and polar solvent-accessiable surface area (PSASA) were important for the toxicities. This study provided some assistance to the toxic assessment and environmental risk assessment of BTs.

benzothiazole; luminescent bacteria; acute toxicity; QSAR

863課題(2014AA06A506)；國家自然科學基金重點課題(51290283)

李曉(1982-)，女，實驗助理，研究方向為水生生態毒理學，E-mail: lixiao8204@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: mamei@rcees.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20141124002

2014-11-24 錄用日期：2014-12-18

1673-5897(2015)2-167-06

X171.5

A

馬梅(1967-)，女，博士，研究員，博士生導師，主要從事水生生態毒理學研究。

李曉, 李娜, 饒凱鋒, 等. 苯并噻唑類污染物對青海弧菌Q67毒性效應[J]. 生態毒理學報, 2015, 10(2): 167-172

Li X, Li N, Rao K F, et al. Toxicities of benzothiazole and benzothiazole derivatives (BTs) to Vibrio qinghaiensis sp. -Q67 [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 167-172 (in Chinese)