幾種抗生素對蛋白核小球藻的時間毒性微板分析法

陳瓊，張瑾，李小猛，劉磊

安徽建筑大學環境與能源工程學院 安徽省水污染控制與廢水資源化重點實驗室，合肥 230601

幾種抗生素對蛋白核小球藻的時間毒性微板分析法

陳瓊，張瑾*，李小猛，劉磊

安徽建筑大學環境與能源工程學院 安徽省水污染控制與廢水資源化重點實驗室，合肥 230601

抗生素在不同的暴露時間可能具有不同的毒性變化規律。本文以蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)為受試生物，96孔微板為暴露實驗載體，5種抗生素硫酸安普霉素、氯霉素、雙氫鏈霉素、硫酸新霉素和硫酸鏈霉素為研究對象，通過在C. pyrenoidosa生長周期內選取6個暴露時間節點(即0、12、24、48、72和96 h)，建立了抗生素在不同暴露時間對C. pyrenoidosa生長抑制毒性的微板測試方法(簡稱T-MTA)，并應用T-MTA方法系統測定了5種抗生素對C. pyrenoidosa在不同暴露時間的生長抑制毒性。結果表明，抗生素對C. pyrenoidosa生長抑制毒性具有明顯的時間依賴特征，即在開始的時候基本無毒性，而后毒性迅速增加，然后毒性增加速度減慢；不同抗生素的毒性隨著暴露時間的延長增加速率不同；同一暴露時間內，5種抗生素對C. pyrenoidosa的毒性大小不同；且毒性順序隨著暴露時間延長而發生變化。

抗生素；蛋白核小球藻；時間依賴毒性；微板毒性分析

越來越多的研究表明，環境污染物的毒性不僅與暴露的劑量有關，暴露時間也是一個重要的因素[1]。如Zhu等[2]采用濃度-時間-效應曲面(CTES)研究發現6種三嗪類除草劑對發光菌Q67的毒性隨著時間的延長而逐漸增加，但不同的毒物，其毒性增加的幅度不同。Hatano等[3]研究發現重金屬對3種水生生物：三葉浮萍、虹鱒魚和大型蚤的毒性均具有很強的時間依賴性。還有的作者發現部分污染物在不同暴露時間的濃度-效應曲線還具有不同的形狀如離子液體對發光菌Q67的毒性效應隨著時間的延長，由抑制發光效應逐漸轉變為刺激發光效應[4-5]。這些研究表明，不同類型和不同結構的污染物可能具有不同的時間毒性規律和作用機制。因此，污染物毒性的檢測不僅要關注其在某一特定時間對暴露生物的效應，更應該著眼于其對暴露生物隨著時間而變化的動態效應[6]。這不僅有助于全面了解污染物的毒性效應，而且能更深入地了解污染物的毒理作用機制與途徑。

綠藻作為生態系統中的初級生產者和水生食物鏈的基本環節，對維持生態系統的平衡起著重要作用。因其個體小、繁殖快、對毒物敏感、易于分離培養以及可直接觀察細胞水平上的中毒癥狀，常被用于測定污染物的毒性。藻毒性測試已成為一種廣泛應用的生物監測與標準方法，如國際標準化組織(ISO)[7]、經濟合作與發展組織(OECD)[8]、美國環保署(USEPA)[9]以及中國國家環境保護總局均將藻類生長抑制毒性試驗作為標準毒性測試方法[10]。蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)屬于綠藻門，小球藻屬，是游離單細胞藻，直徑3～5 μm，球形或橢圓形，繁殖快，可以在較短時間內考察污染物對藻類世代和種群水平上的影響，便于培養和試驗。此外，藻液分布均勻不易沉降，其與污染物的接觸更充分。目前，C. pyrenoidosa已成為囯內外常用的污染物毒性測試的受試生物之一，如利用C. pyrenoidosa測定金屬納米顆粒物的毒性作用[11]，研究十六烷基溴化銨等表面活性劑、商品氯氰菊酯農藥以及藥物等對C. pyrenoidosa的生長抑制效應[12-14]，測試水中砷鉻鉛鎘汞的急性毒性[15]。

然而，目前的藻毒性測試方法多采用三角玻璃瓶法，該方法的缺點：測試儀器不能同時測定大量平行樣品，而且試液用量大，不僅費時、費力而且浪費試劑。因此，袁靜等[16]建立了以酶標儀為檢測儀器和96孔板為載體的藻毒性微板分析法，暴露時間為96 h。利用這一測試體系，研究了多個化合物及其混合物的毒性，包括重金屬、農藥和離子液體等化合物，獲得了大量化合物的完整濃度-效應毒性信息。結果表明，藻微板毒性分析測試法具有操作簡單、靈敏度高、重復性好、節省試劑及環境友好等優點。不幸的是，上述這些藻毒性測試方法只獲得某一暴露時間終點如72 h或96 h的半數效應濃度EC50值，仍不能獲得不同時間的污染物毒性效應變化規律。

醫藥品與個人護理品(pharmaceuticals and personal care products, PPCPs)由于對環境的持續污染和有害性已成為繼POPs之后的又一類新型污染物[17]。抗生素由于使用量大、環境分布廣泛、潛在危害大，是目前PPCPs中最為關注的一類物質[18]。研究發現，抗生素可改變環境中微生物種類，破壞生態系統的平衡[19]；環境中抗生素殘留的持續存在，將誘導出抗藥菌株，通過食物等途徑進入人體，對人類健康產生危害[20]。如Isidori等[21]研究了6種抗生素對非靶生物(水生生物)的急性、慢性和遺傳毒性，發現急性毒性在mg·L-1水平，慢性毒性在μg·L-1水平，氯四環素具有遺傳毒性。劉臻等[22]研究發現氯霉素、紅霉素和四環素能引起熱帶爪蟾圍心腔水腫、泄殖腔增大或拉長、肛門擴張和尾部彎曲等多種畸形現象。因此，研究抗生素類藥物生態環境風險及其污染控制具有重要意義。

綜上所述，本文擬以C. pyrenoidosa為受試生物，以5種抗生素硫酸安普霉素(apramycin sulfate, APR)、氯霉素(chloramphenicol, CHL)、雙氫鏈霉素(dihydrostreptomycin sesquisulfate, DIH)、硫酸新霉素(neomycin sulfate, NEO)和硫酸鏈霉素(strepomycin sulfate, STS)為研究對象，建立基于C. pyrenoidosa的抗生素時間毒性微板分析法(time-dependent microplate toxicity analysis, T-MTA)，并應用T-MTA系統測試5種抗生素對C. pyrenoidos的時間毒性。這不僅提供了上述5種抗生素在不同暴露時間的毒性基礎數據，同時還為研究其他具有時間依賴毒性特征的污染物提供檢測方法與數據分析手段。

表1 5種抗生素的基本性質Table 1 Physical properties of five antibiotics

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑與儀器

試劑：5種抗生素硫酸安普霉素(APR)、氯霉素(CHL)、雙氫鏈霉素(DIH)、硫酸新霉素(NEO)和硫酸鏈霉素(STS)均購自上海原葉生物科技有限公司，其基本理化性質見表1。采用milli-Q水配制抗生素儲備液，保存在棕色瓶中，置于4 ℃冰箱，備用。

主要儀器：BioRad酶標儀(美國Bio-Rad公司)、MGC-250型智能型光照培養箱(上海一恒科技有限公司)、BT25S型五位電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)、70SW-CJ-IF超凈工作臺(蘇州佳寶凈化工程設備有限公司)和Dragon-lab單道可調移液器(10～100 μL)(大龍興創實驗儀器有限公司)。

1.2 藻種與培養

蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)購自中國科學院典型培養物保藏委員會淡水藻種庫(FACHB)，編號為FACHB-5。

SE培養基配方：0.25 g NaNO3、0.075 g K2HPO4·3H2O、0.075 g MgSO4·7H2O、0.025 g CaC12·2H2O、0.175 g KH2PO4、0.025 g NaC1、0.05 mL FeC1·6H2O、1 mL EDTA-Fe、40 mL土壤浸出液和1 mL A5溶液。

EDTA-Fe：1 g Na2EDTA、81 mg FeC13·6H2O、50 mL 0.1 mol·L-1HC1和50 mL H2O。

A5溶液：286 mg H3BO3、181 mg MnC12·4H2O、22 mg ZnSO4·7H2O、7.9 mg CuSO4·5H2O、3.9 mg (NH4)6·Mo7O24·4H2O和100 mL H2O。

收到藻種后，稍松試管管蓋，放入恒溫光照振蕩培養箱，于(25±1) ℃、照度5 000 lx、光暗比l4 h∶10 h條件下培養。每隔10～15 d按1∶2稀釋轉接藻種擴大培養，使之進入對數生長期。接種時間應在白天，藻類細胞代謝最旺盛時期(因傍晚至夜間藻類有細胞下沉現象)。整個過程要求絕對無菌操作。暴露試驗前1～2 d轉接處于對數生長期的藻種至新鮮培養基培養至690 nm波長下光密度(OD690)為0.2～0.3之間，備用。暴露試驗中為避免揮發造成的誤差，微板加上透明蓋[16]。

1.3 微板設計與時間毒性測試

96孔透明微板中空白與污染物濃度梯度設計如圖1所示。在96孔微板的4周共36個孔中均加入200 μL的蒸餾水防止產生邊緣效應；第6，7列共12個孔(b)中分別加入100 μL milli-Q水作為空白對照；第2列6個孔(ci, i=1, 2, 3, 4, 5, 6)以及第4列共6個孔(ci, i=7, 8, 9, 10, 11, 12)分別加入按稀釋因子設計的不同濃度污染物的溶液100 μL；第3和5列分別為第2列和第4列的平行試驗；第8、9、10、11列為第2、3、4、5列的重復實驗。最后在空白和處理孔共60個孔中分別加入密度均勻、吸光度OD690值為0.20～0.30的100 μL藻液，使各孔總體積為200 μL；加透明蓋后置于溫度為(25 ± 1) ℃、光照強度為5 000 lx、光暗比14 h:10 h的光照培養箱中培養，分別在暴露時間節點為0，12 h，24 h，48 h，72 h和96 h時將微板取出，并放入酶標儀中測定OD690。上述微板實驗至少重復3板。

以污染物對C. pyrenoidosa的生長速率μ的抑制率(E)為毒性效應，計算不同暴露時間終點污染物的毒性：

Ei , j=(1-μi , j/μ0 , j)×100%

(1)

μj=(OD690, n-OD690, n-1)/OD690, n

(2)

式中，Ei, j為污染物濃度ci(i=1, 2, 3 ,…, 12)在暴露時間j(j=0, 12, 24, 48, 72, 96 h)對C. pyrenoidosa的生長速率抑制率；μi,j為微板中污染物濃度ci處理孔中C. pyrenoidosa在暴露時間j時的平均生長速率；μ0, j為微板空白孔中C. pyrenoidosa在暴露時間j(j=0 , 12, 24, 48, 72, 96 h)的平均生長速率；μj為微板孔中C. pyrenoidosa在某一暴露時間j(j= 0, 12, 24, 48, 72, 96 h)的平均生長速率；OD690,n為微板孔中C. pyrenoidosa在第n個暴露時間點(n=0, 1, 2, 3, 4, 5, 6)的平均吸光光度值；OD690,n-1為微板孔中C. pyrenoidosa在第n-1個暴露時間點的平均吸光光度值。

圖1 時間毒性微板分析法中微板設計示意圖注：b，空白；ci，第i個濃度。Fig. 1 Schematic diagram of the microplate design in a time-dependent toxicity microplate analysis where b refers to blank and ci to the concentration of the ith treatment

1.4 時間毒性數據處理

為了揭示不同暴露時間、不同濃度污染物對C. pyrenoidosa生長抑制毒性變化規律，需要對不同時間節點的濃度—效應數據進行非線性最小二乘擬合。對于濃度—效應曲線(concentration-response curve, CRC)的濃度—效應數據，采用兩參數非線性函數Weibull和Logit進行擬合，選擇擬合值與試驗觀測值之間的相關系數(correlation coefficient, R)與均方根誤差(root mean square error, RMSE)評價CRC模型的擬合優度，R值越大、RMSE越小，擬合越好[23]。2個用于描述實驗毒性數據的非線性函數Weibull和Logit如式(3)和(4)所示：

E=1/(1+exp(-α-βlog10(c)))

(3)

E=1-exp(-exp(α+βlog10(c)))

(4)

式中α、β是Weibull和Logit的位置與斜率參數，E為效應即污染物對綠藻C. pyrenoidosa的生長抑制率；c是污染物的濃度。

2 結果(Results)

2.1 同步生長速率曲線和測定波長選擇

為了檢測時間依賴毒性測試過程中C. pyrenoidosa是否處于對數生長期，我們在所有實驗中，均單獨設置一塊96孔板同步測試C. pyrenoidosa在微孔中的生長曲線，其微板設計與時間依賴毒性測試類似：微板周邊的36個微孔加入200 μL蒸餾水，在剩余60個孔中均加入體積100 μL的蒸餾水，再加入100 μL已培養好的藻液，使試液總體積達到200 μL。結果見圖2(A)，綠藻C. pyrenoidosa在微板中經短暫適應期后開始快速增長，36 h后C. pyrenoidosa生長速率快速增加，72 h后開始下降，96 h后幾乎下降到初始生長速率，120 h后幾乎不再生長。因此，時間依賴毒性實驗的測試時間長度最長設置在96 h。

用1 cm比色皿、在波長350～850 nm范圍內、按步長1 nm測定C. pyrenoidosa的紫外一可見吸收光譜圖譜，結果見圖2(B)。由圖2(B)可見，在波長為446、504和690 nm處存在吸收峰，其中690 nm吸收峰最尖，光譜干擾較少，因此，綠藻C. pyrenoidosa的光密度OD值的測定選擇690 nm波長處的吸收峰。

圖2 C. pyrenoidosa的生長特性Fig. 2 Growth characteristic of Chlorella pyrenoidosa

2.2 濃度-效應曲線CRC

由時間毒性微板分析法測得的5種抗生素在不同暴露時間節點的濃度-效應數據(點)以及通過非線性最小二乘擬合方法得到的統計量與回歸系數(位置參數α和斜率參數β)結果見表2，并將擬合所得的CRC曲線繪于圖3。

從表2可看出，Logit函數對暴露時間在48～96 h的毒性數據擬合的結果較好(R>0.91, RMSE<0.1)，但對暴露時間節點為24 h的濃度-效應數據擬合效果稍差，如CHL的濃度-效應數據的R值為0.6307，對0和12 h的濃度-效應數據不能有效擬合，可能因為在暴露時間24 h以內，藻的生長處于延遲期，數據不穩定造成的，也可能是擬合函數不太合適。以半數效應濃度(EC50)的負對數pEC50為毒性指標，5種抗生素的毒性均隨著暴露時間的延長而在逐漸增強即具有典型的時間依賴特征。但不同抗生素在同一暴露時間的毒性不同，且毒性大小順序隨著時間延長而變化，如在暴露時間節點24 h時，5種抗生素的毒性大小順序：CHL

表2 5種抗生素在6個時間點的擬合函數(Logit函數的α和β)、擬合統計量(R和RMSE)以及EC50和pEC50值Table 2 The regression parameters (α and β of Logit function), two statistics (R and RMSE), EC50 and pEC50 of five antibiotics at six time points

圖3 5種抗生素在6個時間節點的濃度-效應曲線Fig. 3 Concentration-response curves of five antibiotics at six time points

圖4 5種抗生素毒性隨時間的變化曲線Fig. 4 Plot of pECx versus time for five antibiotics

圖3也顯示5種抗生素均表現出明顯的時間依賴毒性特征：在0～24 h，5種抗生素對C. pyrenoidosa基本無毒性，然后隨著暴露時間的延長，毒性逐漸增加，在24～48 h內毒性增加速度最快，此后毒性增加速度逐漸減慢。

3 討論(Discussion)

環境污染物的毒性不僅與暴露的劑量有關，暴露時間也是一個重要的因素。已有研究表明污染物對發光菌Q67的毒性具有時間依賴特征[24-26]。本文中5種抗生素對綠藻C. pyrenoidosa的毒性也具有明顯的時間依賴特征。為了進一步說明5種抗生素對C. pyrenoidosa的毒性具有明顯的時間依賴特征，我們將每種藥物的4個典型pECx值：pEC20、pEC30、pEC40和pEC50隨著時間變化趨勢繪成圖4。如圖4所示，5種抗生素的毒性值pEC20、pEC30、pEC40和pEC50均隨著時間的延長而增加，但不同的抗生素增加規律不同。如APR、CHL和NEO的pEC20與pEC30值在0～12內幾乎為0，在12～24 h內毒性迅速增加，然后增加速度減慢，而pEC40和pEC50值在0～24 h內幾乎為0，在24～48 h內迅速增加，然后增加速度減慢。但是，CHL的4個毒性值pEC20、pEC30、pEC40和pEC50之間的差異較小。STS的pEC20值在0～12 h內幾乎為0，在12～24 h內迅速增加，然后增加速度減慢，而pEC30、pEC40和pEC50值在0～24 h內幾乎為0，在24～48 h內迅速增加，然后增加速度減慢。DIH的pEC20與pEC30值在0～24 h內幾乎為0，在24～48 h內迅速增加，然后增加速度減慢，而pEC40和pEC50值在0～48 h內幾乎為0，在48～72 h內迅速增加，然后增加速度減慢。這與林楠等所獲的研究結論類似[24]。

上述研究結果顯示，污染物的毒性大小及其變化規律也會隨暴露時間延長出現變化，這就要求我們在進行污染物生態毒性評價時應進行實時分析，同時考慮濃度與時間2個因素，才能全面了解污染物的毒性效應，更深入的了解污染物的毒性作用機制與途徑，更能體現實際環境中污染物暴露的現象和信息，同時提高生態風險評估的可信性[6]。

本文建立了不同暴露時間下污染物對綠藻C. pyrenoidosa的生長抑制毒性的微板測試分析方法，并成功地應用于環境中普遍存在的5種抗生素APR、STS、DIH、NEO和CHL對C. pyrenoidosa的時間依賴毒性測試。5種抗生素對綠藻C. pyrenoidosa的毒性均隨著時間的延長而增加：在開始的24 h內基本無毒性，然后隨著時間的延長，毒性迅速增加，而后毒性增加的速度逐漸減慢。5種抗生素對C. pyrenoidosa在同一暴露時間的毒性大小不同。且在不同的暴露時間節點，5種抗生素的毒性順序也不同。以半數效應濃度(EC50)的負對數pEC50為毒性指標，在24 h暴露時間節點的毒性順序：CHL

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Time-dependent Microplate Toxicity Analysis (T-MTA) of Several Antibiotics toChlorellapyrenoidosa

Chen Qiong, Zhang Jin*, Li Xiaomeng, Liu Lei

Key Laboratory of Water Pollution Control and Wastewater Resource of Anhui Province, College of Environment and Energy Engineering, Anhui Jianzhu University, Hefei 230601, China

30 June 2014 accepted 14 August 2014

Antibiotics probably have different toxicity features in different exposure times. Selecting Chlorella pyrenoidosa (C. pyrenoidosa) as a test organism, 96-well microplate as exposure experiment carrier and five antibiotics, apramycin sulfate, chloramphenicol, dihydrostreptomycin sesquisulfate, neomycin sulfate and strepomycin sulfate, as test chemicals, a time-dependent microplate toxicity analysis (T-MTA) was developed. Using the T-MTA, the time-dependent toxicities of the five antibiotics on C. pyrenoidosa were determined at six exposure time points such as 0, 12, 24, 48, 72 and 96 h. The results showed that the toxicities of the antibiotics exhibited significant time-dependent features, i.e., they had almost no toxicities on C. pyrenoidosa at first, then their toxicities increased rapidly, and finally increased slowly. However, the antibiotics had different increasing rates for the time-dependent toxicities. The toxicities of five antibiotics were different at the same exposure time. Moreover, the orders of toxicity of the antibiotics at different exposure times were different.

antibiotics; Chlorella pyrenoidosa; time-dependent toxicity; microplate toxicity analysis

國家自然科學基金(21207002)；博士科研啟動基金；大學生科技創新性實驗(201310878060；AH201310878107)

陳瓊(1988-)，男，碩士，研究方向為污染物化學與毒理學，E-mail: 13093549315@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: ginnzy@163.com

10.7524/AJE.1673-5897.20140630004

2014-06-30 錄用日期：2014-08-14

1673-5897(2015)2-190-08

X13

A

張瑾(1978—)，女，博士，副教授，近年主要從事有機污染物化學與毒理學研究，發表學術論文30余篇。

陳瓊, 張瑾, 李小猛, 等. 幾種抗生素對蛋白核小球藻的時間毒性微板分析法[J]. 生態毒理學報, 2015, 10(2): 190-197

Chen Q, Zhang J, Li X M, et al. Time-dependent microplate toxicity analysis (T-MTA) of several antibiotics to Chlorella pyrenoidosa [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 190-197 (in Chinese)