日糧中銅脅迫對吉富羅非魚幼魚抗氧化、脂質過氧化及肝臟組織結構的影響

王文龍，崔欣，安立龍,*，效梅，高涵，李成成，邢星，李延偉，許英梅

1. 廣東海洋大學 動物科學系，湛江 524088 2. 廣東海洋大學 動物醫學系，湛江 524088 3. 中國藥科大學 藥物制劑系，南京 211198 4. 中華人民共和國欽州保稅港區出入境檢驗檢疫局，欽州 535008

日糧中銅脅迫對吉富羅非魚幼魚抗氧化、脂質過氧化及肝臟組織結構的影響

王文龍1，崔欣1，安立龍1,*，效梅2,#，高涵3，李成成1，邢星4，李延偉1，許英梅1

1. 廣東海洋大學 動物科學系，湛江 524088 2. 廣東海洋大學 動物醫學系，湛江 524088 3. 中國藥科大學 藥物制劑系，南京 211198 4. 中華人民共和國欽州保稅港區出入境檢驗檢疫局，欽州 535008

吉富羅非魚是我國南方沿海地區水產養殖中的主要經濟魚類之一，但近年來，隨著我國城鎮化和工業化進程的推進，羅非魚養殖面臨著前所未有的銅富集的挑戰。為探明日糧中銅脅迫對吉富羅非魚幼魚抗氧化系統和肝臟組織結構的影響，將1 080條羅非魚幼魚暴露于6個濃度梯度(0、3、30、300、1 000、3 000 mg·kg-1)的高銅日糧中，通過60 d的暴露試驗，實時測定羅非魚血清與肝臟抗氧化能力，監測肝臟病理變化。結果表明，在本試驗條件下，羅非魚幼魚血清和肝臟中MDA的含量隨日糧中銅含量的增加和脅迫時間的延長顯著升高，而SOD、GSH-PX和CuZn-SOD的活性表現出先升高后降低的趨勢；各組間肝臟表現出不同程度的病變，主要是濁腫變性和脂肪變性，且第Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組肝臟病變嚴重。綜上，日糧中銅脅迫對吉富羅非魚幼魚的抗氧化機能有較明顯的抑制作用，長時間的暴露能嚴重損傷其肝臟的組織結構，因此，建議吉富羅非魚幼魚日糧中銅的實際含量應控制在42.36 mg·kg-1以下。

日糧中銅脅迫；吉富羅非魚幼魚；肝臟病變；抗氧化；脂質過氧化；濁腫變性

現代工業社會、社會經濟和人類各種生產活動都會引起重金屬的輸入，對生態環境造成嚴重的危害[1-3]，特別是近幾十年來隨著我國工業化進程的不斷升級，日益加劇的重金屬污染及其引發的生態和食品安全問題成為我國學者關注的焦點[1,4]。銅(copper, Cu)是主要的重金屬之一，也是有機生命正常生理生化反應必須的微量元素之一[5]，但過量的Cu則會導致毒性效應，對生物體機體造成損傷[2,6]，Cu在水生生物體內的富集已經成為無法規避的安全隱患。

早在20世紀90年代，西方學者就已經預見到了水源性和食源性Cu暴露對水生生物的毒害作用[6-7]，引發了人們的廣泛關注。而我國針對Cu的生態毒性研究起步較晚，隨著90年代中后期我國地域環境中Cu的輸入量逐漸攀高，Cu等重金屬引發的生態風險和食品安全問題才慢慢進入我國學者的視野，過量的Cu對水生動物肝臟造成巨大傷害，進而影響動物機體的抗氧化體系的正常運轉，引發動物機體代謝、免疫等諸多方面功能紊亂[2,4,6]。目前關于日糧中高Cu脅迫對畜禽的毒性作用的報道比較多，但日糧中Cu暴露對魚類的毒性研究較少，未見探討日糧中Cu暴露影響羅非魚抗氧化功能、脂質過氧化和肝臟組織結構的報道，少數的相關研究僅限于對Cu最適添加量的探索，汪華[8]的研究表明，吉富羅非魚的日糧Cu需要量為8 mg·kg-1左右，但為保證魚對Cu的需要量，魚日糧中Cu的實際含量往往大于其實際需要量，且在不同飼養環境和飼養條件下魚的需要量和耐受度也不盡相同[9-11]。

本課題組立足于現今重金屬污染愈發嚴重，兩廣、福建等地區水生生物Cu等重金屬富集加劇的大背景下開展了一系列關于羅非魚Cu耐受以及Cu暴露條件下羅非魚機體抗氧化響應機制的工作，前期研究表明，Cu在各組織中積累量的順序依次為：肝臟>脾臟>腸道>鰓>肌肉，與對照組相比，肝臟、脾臟、腸道中Cu的含量隨著時間和日糧中Cu濃度的升高而逐漸升高[4]，肝臟是Cu最大的儲存器官，也是魚體內最重要的解毒器官，其病理變化可以直觀地反映出Cu痕量長時間蓄積或大量短時攝入對魚體造成損傷，與此同時，血清生化指標也能敏感地反映動物機體的生理狀態，基于此，本文以飼喂Cu暴露日糧的吉富羅非魚幼魚為模型，研究日糧中Cu暴露對羅非魚幼魚抗氧化、脂質過氧化和肝臟組織結構的影響，探究日糧Cu暴露對吉富羅非魚幼魚機體抗氧化系統及功能臟器的損傷機制，為羅非魚養殖中日糧Cu的需要量和使用限量研究提供依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗動物與材料

試驗魚由廣東省吳川國聯羅非魚良種場提供，試驗前用藥浴消毒(投入0.02%的高錳酸鉀溶液浸泡5 min，將有不良反應的病魚去除)，用對照組日糧馴養15 d，使其適應試驗環境及試驗日糧，選擇健康無病、活躍靈敏的個體作為試驗用魚；試驗中Cu以CuSO4·5H2O(分析純，上海易蒙斯化工科技有限公司)形式添加。

1.2 試驗日糧

以魚粉、豆粕、玉米粉、面粉、磷酸二氫鈣、豆油、膽堿、食鹽、預混料配制基礎日糧，經粉碎后過60目篩后混勻，微量原料采用逐級擴大法混合，混合均勻后-20 ℃密封保存，備用，試驗基礎日糧及營養組成見表1。試驗中設計Cu的添加梯度為：0 mg·kg-1、3 mg·kg-1、30 mg·kg-1、300 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1、3 000 mg·kg-16個水平，用電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS，美國安捷倫科技有限公司)測得各組日糧中Cu的實際含量如表2所示。

表1 試驗基礎日糧及營養水平(飼喂基礎)Table 1 Ingredients and nutrient level of basal diet (fed-basis)

注：*每千克預混料含VA 350 000 IU、VD3100 000 IU、VE 4 000 mg、VK3250 mg、VB1400 mg、VB21 500 mg、VB6600 mg、VB122.5 mg、D-泛酸鈣2 000 mg、煙酰胺2 500 mg、葉酸250 mg、D-生物素5 mg、肌醇7 000 mg、VC 6 300 mg、鋅2 250 mg、錳1 200 mg、鐵6 500 mg、鈷120 mg、碘120 mg、硒25 mg。

Note:*Each kilogram of premix provided: VA 350 000 IU, VD3100 000 IU, VE 4 000 mg, VK3250 mg, VB1400 mg, VB21 500 mg, VB6600 mg, VB122.5 mg, calcium D-pantothenate 2 000 mg, nicotinamide 2 500 mg, folic acid 250 mg, biotin 5 mg, Inositol 7 000 mg, VC 6 300 mg, Zn 2 250 mg, Mn 1 200 mg, Fe 6 500 mg, Co 120 mg, I 120 mg, Se 25 mg.

1.3 試驗分組與飼養管理

選取健康無病的羅非魚1 080尾(平均體重為(9.20±0.18) g)，將其分為6組(見表2)，每組3個重復，每個重復60尾，飼養在規格為500 L的玻璃鋼魚缸中?？諝鈮嚎s機增氧，每3天監測一次水質：水溫為(31.50±1.50) ℃，溶解氧不小于5 mg·L-1，氨氮含量不超過0.02 mg·L-1，水體pH為7.8～8.3；每3天換水1/2缸，每天上午9點和下午6點投放2次相應組別的日糧，日投料量為魚體重的3%(每10天測一次魚的平均體重，及時調整日投料量)，30 min后將剩余餌料吸出，烘干稱重，每天觀察記錄羅非魚攝食和死亡情況。

表2 試驗分組Table 2 Design of experiment

1.4 樣品采集與指標測定

分別于試驗第20天、40天、60天采樣，采樣前饑餓24 h，每個重復取12條魚，其中4尾進行尾靜脈采血，室溫靜置待其凝固后3 000 r·min-1離心10 min，取制得的血清于-20 ℃保存，待測；余下的8尾魚則采用搗毀腦髓法處死，其中6尾取肝臟用4 ℃預冷的生理鹽水漂洗并濾干，切1.0 g左右肝臟組織塊制成10%組織勻漿，冷凍離心機(3K30，德國SIGMA公司)2 500 r·min-1離心10 min，取上清液于-20 ℃保存，待測。脂質過氧化與抗氧化指標的測定均嚴格按照南京建成生物工程研究所相應試劑盒的使用說明進行。

取其余2尾的新鮮肝臟、脾臟用4 ℃預冷的生理鹽水漂洗并濾干，切成大小約為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小組織塊放于配好的波音氏(Bouin’s)固定液中固定(波音氏液的體積約為組織塊的15～20倍)，固定24 h；再經脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(5 μm)、展片、烘干、水洗、染色，最后用中性樹膠封片，貼上標簽并編號，備用，Nikon-E200顯微鏡下觀察并拍照(Olympus DP70顯微成像系統，奧林巴斯中國有限公司)。

1.5 數據處理

采用SPSS 20.0軟件對試驗數據進行單因素方差分析，采用Duncan’s法多重比較差異的顯著性，差異顯著定義為P<0.05，數據表示為“Mean±SD”。

2 結果(Results)

2.1 日糧Cu脅迫對羅非魚幼魚抗氧化、脂質過氧化的影響

2.1.1 日糧Cu脅迫對羅非魚幼魚MDA含量的影響

由表3可見血清中MDA的含量略低于肝臟中MDA的含量。在第20、40、60天時，對照組～Ⅱ組血清中MDA的含量無顯著差異，Ⅲ～Ⅴ組血清中MDA的含量隨著Cu的升高而逐漸升高，第60天時第Ⅴ組血清MDA的含量達到最高(7.08±0.04) nmol·mL-1。

隨著日糧Cu脅迫時間的延長，對照組～Ⅲ組血清中MDA的含量無顯著差異(P>0.05)。第Ⅳ組血清中MDA的含量隨時間的延長顯著升高，而第Ⅴ組在第40天時比在第20天時顯著升高(P<0.05)，到60 d時無顯著變化(P>0.05)。說明日糧中高劑量的Cu可引起脂質過氧化，使血清中MDA含量升高。

肝臟中MDA含量的變化與血清中MDA的變化規律相似。肝臟中MDA含量在第20天時對照組～Ⅲ組間無顯著差異(P>0.05)；第Ⅳ組和第Ⅴ組顯著高于其他組。第40天時，第Ⅰ組中MDA的含量最少，為(5.35±0.02) nmol·mg-1prot，但之后隨著日糧中Cu濃度的升高，肝臟中MDA的含量也隨著升高；而與對照組相比，第Ⅳ、Ⅴ組肝臟中MDA的含量顯著升高(P<0.05)。第60天時，肝臟中MDA的含量隨日糧中Cu濃度的升高而升高，第Ⅴ組肝臟中MDA的含量此時達到最高，為(8.69±0.05) nmol·mg-1prot。對照組～第Ⅳ組肝臟中MDA的含量隨時間的延長無顯著變化(P>0.05)，而第Ⅴ組肝臟中MDA的含量隨時間的延長顯著增加(P<0.05)，其原因可能是日糧中高Cu引起脂質過氧化，使肝臟中MDA含量升高。

2.1.2 日糧Cu脅迫對羅非魚幼魚SOD活性的影響

如表4所示，血清中SOD的活性與肝臟差異不顯著。在20 d時，對照組～第Ⅱ組血清中SOD的活性無顯著差異(P>0.05)，之后隨著Cu的升高SOD的活性也逐漸增強。40 d時，第Ⅲ組SOD的活性最高，第Ⅴ組次之，最低為第Ⅰ組。60 d時，隨著日糧中Cu濃度的升高，SOD的活性呈現先升高再降低的趨勢，最高是第Ⅱ組，達到了(115.71±7.25) U·mL-1。對照組和第Ⅰ組血清中SOD的活性隨著日糧Cu脅迫時間的延長無顯著變化，第Ⅱ組隨著時間的延長而升高，第Ⅲ組呈先升高后降低的趨勢，第Ⅳ、Ⅴ組均呈下降的趨勢，且SOD活性在第60天時顯著低于第20天時的活性(P<0.05)。

肝臟中SOD的活性在20 d時，隨著日糧中Cu濃度的升高也逐漸升高。40 d時，第Ⅲ組SOD的活性最高，達到(126.15±19.27) U·mg-1prot。第60天時，第Ⅰ組SOD的活性最高，為(120.26±14.03) U·mg-1prot，在這2個時期，SOD的活性均隨Cu濃度的升高呈現拋物線型變化。

表3 日糧Cu脅迫條件下羅非魚幼魚的MDA含量Table 3 Concentration of MDA in juvenile GIFT tilapia under dietary Cu stress

注：同行或同列肩標中大寫或小寫字母完全不同，表示顯著差異(P<0.05)，未標字母或字母有相同者表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

Note: In the same row or column, values with totally different uppercase or lowercase superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same letter or no letter mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表4 日糧Cu脅迫條件下羅非魚幼魚的SOD活性Table 4 Activity of SOD in juvenile GIFT tilapia under dietary Cu stress

表5 日糧Cu脅迫條件下羅非魚幼魚的CuZn-SOD活性Table 5 Activity of CuZn-SOD in juvenile GIFT tilapia under dietary Cu stress

隨著日糧Cu脅迫時間的延長，對照組肝臟中SOD的活性無顯著變化(P>0.05)，第Ⅰ組呈上升趨勢，但無顯著差異，第Ⅱ、Ⅲ組為先升高再降低的趨勢，而第Ⅳ、Ⅴ組呈下降趨勢，且差異顯著(P<0.05)，說明日糧中高劑量的Cu可能會抑制血清和肝臟中SOD的活性。

2.1.3 日糧Cu脅迫對羅非魚幼魚CuZn-SOD活性的影響

由表5可知，在第20天時，各組間血清中CuZn-SOD的活性無顯著差異(P>0.05)，第Ⅳ組最低，為(81.05±11.02) U·mL-1，最高的第Ⅲ組為(88.92±7.43) U·mL-1；第40天時，對照組和Ⅱ、Ⅲ組間無顯著差異(P>0.05)，Ⅰ組和Ⅳ、Ⅴ組間無顯著差異(P>0.05)；第60天時，隨日糧中Cu濃度的升高總體呈現出降低的趨勢，且與對照組相比，Ⅳ、Ⅴ組顯著降低(P<0.05)。

隨著日糧Cu脅迫時間的延長，第Ⅴ組血清中CuZn-SOD的活性顯著降低(P<0.05)，在第20天時為(84.51±6.53) U·mL-1，第60天時則降至(76.43±12.72) U·mL-1，其他各組隨日糧Cu脅迫時間的延長無顯著變化(P>0.05)。

肝臟中CuZn-SOD的活性略低于血清。在第20天時，各組間無顯著差異；第40天和60天時，肝臟CuZn-SOD的活性都隨著日糧中Cu濃度的升高而呈現出先升高后降低的趨勢，第Ⅱ組在第60天時最高，為(71.68±8.32) U·mg-1prot，顯著高于對照組(P<0.05)。

隨著日糧Cu脅迫時間的延長，對照組和Ⅰ、Ⅱ組肝臟中CuZn-SOD的活性無顯著變化(P>0.05)；第Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組均隨時間的延長逐漸降低，第Ⅴ組在60 d時最低，為(57.92±6.25) U·mg-1prot；表明日糧中過高濃度的Cu可能會抑制羅非魚血清和肝臟中CuZn-SOD的活性。

2.1.4 日糧Cu脅迫對羅非魚幼魚GSH水平和GSH-PX活性的影響

由表6可知，肝臟中GSH的含量在20 d時隨日糧中Cu濃度的升高逐漸升高，最高的第Ⅴ組達到了(7.23±0.15) mg·g-1prot，顯著高于對照組(P<0.05)；在40 d時，各組間無顯著差異(P>0.05)；在60 d時，隨日糧中Cu含量的升高GSH含量逐漸下降。

隨著日糧Cu脅迫時間的延長，對照組～第Ⅲ組無顯著變化，第Ⅳ組GSH含量緩慢下降，但差異不顯著，第Ⅴ組隨著時間的延長顯著下降(P<0.05)，第60天時降至最低的(5.20±0.24) mg·g-1prot，這也表明日糧中過高劑量的Cu可能會降低肝臟中GSH的含量。

表6 日糧Cu脅迫條件下羅非魚幼魚肝臟中的 GSH水平(U·mg-1 prot)Table 6 Concentration of GSH in liver of juvenile GIFT tilapia under dietary Cu stress (U·mg-1 prot)

如表7所示，在20 d時，第Ⅳ組和第Ⅴ組GSH-PX的活性分別為(28.64±2.04) U·mg-1prot和(27.75±1.38) U·mg-1prot，顯著高于對照組(P<0.05)。到第60天時，隨日糧中Cu含量的升高，各組間呈現先升高后降低的變化趨勢，與對照組相比，第Ⅳ、Ⅴ組GSH-PX的活性顯著降低(P<0.05)。

對照組和Ⅰ、Ⅱ組中GSH-PX的活性隨著日糧Cu脅迫時間的延長無顯著變化，第Ⅱ組在40 d時含量最低；第Ⅲ組GSH-PX的活性隨著時間的延長逐漸升高，而第Ⅳ、Ⅴ組隨時間的延長逐漸降低，表明日糧中過高劑量的Cu也可能會抑制GSH-PX的活性。

2.2 日糧Cu脅迫對羅非魚幼魚肝臟組織結構的影響

2.2.1 肝臟病理解剖的觀察

第20天時，解剖發現對照組與第Ⅰ～Ⅳ組肝臟顏色正常，表面濕潤光滑，質地柔軟，富有彈性；第Ⅴ組肝臟顏色略發黃，質地柔軟，彈性略差。第40天時，對照組與第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組肝臟依舊正常，而第Ⅳ組肝臟顏色發黃，彈性變差；第Ⅴ組肝臟顏色呈淡黃色，質地脆軟，部分出現顆粒變性。第60天時，對照組與第Ⅰ、Ⅱ組肝臟表現正常，第Ⅲ組肝臟顏色略發黃。第Ⅳ組肝臟顏色為土黃色，質地脆軟，出現顆粒變性。第Ⅴ組肝臟顏色呈土黃色，質地脆軟易碎，有明顯的顆粒變性，部分可見出血斑點。

2.2.2 肝臟組織切片的觀察

第20天時，對照組和第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組肝臟細胞結構正常，肝細胞呈圓形或多角形，細胞膜完整清晰，細胞核圓形，染色比較深，細胞質染色較淺(圖1-A1)，肝小葉周邊細胞呈放射狀排列整齊，肝索結構明顯(圖1-A2)；第Ⅳ組肝臟細胞中有較小的分散的空泡，細胞界限不清晰(圖1-B1)；第Ⅴ組肝細胞中圓形空泡較多，肝細胞擁擠腫大，核固縮現象明顯，細胞界限模糊，出現輕度的脂肪變性(圖1-B2)。

表7 日糧Cu脅迫條件下羅非魚幼魚肝臟中的GSH-PX活性(mg·g-1 prot)Table 7 Activity of GSH-PX in liver of juvenile GIFT tilapia under dietary Cu stress (mg·g-1 prot)

圖1 日糧Cu脅迫條件下羅非魚幼 魚肝臟組織病理變化圖注：H.E, ×400；其中，A1、A2為第20天時肝臟正常結構圖， B1、B2分別為第20天時Ⅳ組和Ⅴ組的肝臟結構圖， C1、C2、C3分別為第40天時Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組的肝臟結構圖， D1、D2、D3分別為第60天時Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組的肝臟結構圖。Fig. 1 The pathological changes of livers of juvenile GIFT tilapia under dietary Cu stressNote: H.E, ×400; A1 & A2, the normal structure of livers in 20th day; B1, B2, the histological structure of livers in group Ⅳ and Ⅴ in 20th day; C1, C2, C3, the histological structure of livers in group Ⅲ, Ⅳ and Ⅴ in 40th day; D1, D2, D3, the histological structure of livers in group Ⅲ, Ⅳ and Ⅴ in 60th day.

第40天時，對照組和第Ⅰ、Ⅱ組肝臟細胞結構正常；第Ⅲ組肝臟細胞出現分散的空泡，細胞界限模糊，有輕微的核固縮現象(圖1-C1)；第Ⅳ組肝臟出現輕度的脂肪變性，細胞空泡變大，肝索紊亂，細胞漿內出現細顆粒物質(圖1-C2)；第Ⅴ組肝臟脂肪變性加重，空泡明顯變大，出現局灶性壞死(圖1-C3)。

第60天時，對照組和第Ⅰ組肝臟細胞結構正常；第Ⅱ組肝臟細胞出現分散的空泡，細胞界限開始模糊；第Ⅲ組肝臟細胞中分散空泡變大，細胞界限更加模糊，核固縮現象明顯，出現輕度脂肪變性(圖1-D1)；第Ⅳ組肝臟出現大面積的脂肪變性，細胞結構破壞，呈紊亂的一片紅色(圖1-D2)；第Ⅴ組肝臟遭到嚴重破壞，局灶性壞死現象加劇，壞死處肝細胞崩解(圖1-D3)。

3 討論(Discussion)

脂質過氧化(lipid peroxidation, LPO)是反應脂質過氧化作用強弱的重要指標之一[12]。劉向陽等[13]在日糧中分別添加Cu 0.54 mg·kg-1(缺Cu)和6.05 mg·kg-1(正常Cu)，發現缺Cu組肝臟中MDA比正常組提高了18%，血漿中MDA也相應升高9%，且肝臟中MDA的含量顯著高于血漿中的含量。在本實驗中，肝臟中MDA的含量略高于血清中MDA的含量，對照組與前3組血清中MDA的含量隨時間的延長無顯著變化，說明日糧中添加低于300 mg·kg-1Cu時，沒有造成明顯的脂質過氧化；而當日糧中Cu含量升高為1 057.29 mg·kg-1時，血清中MDA的含量漸漸升高；當添加量達到3 000 mg·kg-1后，血清中MDA的含量隨脅迫時間的延長明顯升高，表明在本試驗條件下，日糧中Cu含量為1 057.29 mg·kg-1時，可引起羅非魚血清中的脂質過氧化，同樣在肝臟中也可得到類似的結論。

生物體內參與清除過氧化因子的物質主要包括：SOD、CuZn-SOD、GSH和GSH-PX等。在本研究中低濃度組血清中SOD的活性無顯著差異，而高濃度組與對照組相比在前期顯著升高，之后又逐漸降低。肝臟中SOD的活性在日糧中Cu含量為1 057.29 mg·kg-1和3 086.76 mg·kg-1時也表現出先升高后降低的趨勢，且隨著日糧中Cu濃度的升高，肝臟中SOD的活性呈下降趨勢。Knox等[14]研究表明，肝臟中SOD的活性隨著日糧中Cu含量的升高而降低，這與本研究的結果一致。魯雙慶等[15]在研究Cu對黃鱔肝臟保護酶SOD、CAT、GSH-PX活性的影響時發現，隨著時間的推移，SOD活性表現出先抑制，之后升高又降低的變化趨勢，本試驗前期沒有發現有抑制現象，這可能與Cu的濃度或脅迫時間的長短有關。肝臟是動物體內重要的解毒器官，有較強的主動調節能力，當Cu濃度升高時，羅非魚肝臟會產生適應性的誘導反應，此時SOD活性增強，清除自由基使機體免受傷害，但當Cu濃度繼續升高，或時間繼續延長，超過肝臟的耐受極限，肝臟就會表現出中毒反應，最后導致SOD活性下降[16]。CuZn-SOD是所有生物體的一種重要的自由基清除劑，保護機體免受超氧陰離子的損害[17]。喬永剛[18]分別以硫酸銅和蛋氨酸銅為Cu源，在軍曹魚基礎日糧中添加0、4、8、16、32、64 mg·kg-1Cu，發現對軍曹魚肝臟中CuZn-SOD的活性無顯著影響。本試驗中，對照組與前3組血清中CuZn-SOD的活性沒有顯著差異，這與喬永剛[18]的研究相一致；但當Cu含量超過1 000 mg·kg-1時，隨著日糧中Cu脅迫時間的延長，CuZn-SOD的活性下降，而且隨著日糧中Cu濃度的升高CuZn-SOD的活性也隨之下降。肝臟中CuZn-SOD的活性也隨著日糧中Cu的增加而下降，且日糧中Cu的添加量超過300 mg·kg-1時，隨著時間的推移，CuZn-SOD的活性就開始下降，這也表明肝臟中CuZn-SOD的活性比血清中CuZn-SOD的活性更敏感，而且高Cu抑制了CuZn-SOD的活性。這可能是由于隨著Cu含量的升高，自由基反應的速度加快，沒有被及時清除的氧自由基就會破壞細胞結構，加速細胞衰老，損害細胞，因此，CuZn-SOD的活性降低可能與細胞解毒能力的過飽和有關。還原型谷胱甘肽(GSH)在分解過氧化物時起重要作用，也是生物體內含量豐富的抗氧化劑。劉慧等[19]在研究Cu對鯽魚肝臟谷胱甘肽的影響時發現，在不同濃度的Cu誘導下，GSH含量升高，且認為肝臟GSH含量的升高是機體對Cu濃度升高的適應性反應。而在本試驗前期，隨著日糧中Cu含量的升高肝臟中GSH的含量也隨之升高，這和劉慧等的研究結果一致。但在中后期第Ⅳ組和第Ⅴ組肝臟中GSH的含量開始下降，尤其是第Ⅴ組與對照組相比顯著下降，而其他組沒有顯著變化，表明低濃度的Cu并沒有對GSH產生誘導作用。而高濃度組GSH的含量隨著暴露時間的延長而降低，可能是羅非魚在高濃度Cu的脅迫下產生的大量活性氧直接與GSH結合，消耗了GSH；或是高濃度的Cu使得以GSH為底物的酶GSH-PX活性受到抑制，導致的GSH含量下降[20]。GSH-PX是生物體內廣泛存在的一種酶，它能催化H2O2分解，從而保護細胞免受損害[21]。本實驗中，在第20天時，隨著日糧中Cu含量的升高，肝臟中GSH-PX的活性也隨之升高，這與Shao等[22]的研究結果一致。而劉慧等[23]報道也表明較高濃度的Cu對彭澤鯽魚肝臟中GSH-PX的活性均有不同程度的抑制作用；王凡等[24]也發現，隨著Cu濃度的升高，櫛孔扇貝內臟團中GSH-PX的活性表現出先抑制后誘導又抑制的規律。在本研究中，高濃度組隨著時間的延長，肝臟中GSH-PX的活性也隨之降低，而且在60 d時，隨著日糧中Cu的升高，各組也表現出降低的趨勢，這與劉慧等[23]、王凡等[24]的研究結果一致，機制可能是因為Cu含量升高，羅非魚肝臟中對谷胱甘過氧化物酶代謝外源化合物的能力已達到飽和，或者可能是過氧化氫酶(消耗H2O2比GSH-PX快)活性顯著提高，抑制了GSH-PX的活性。日糧中高Cu脅迫可促使膜脂質過氧化產物MDA含量增加，破壞細胞膜結構，對機體造成一定的損傷，同時，羅非魚肝臟和血清中SOD活性與肝臟中GSH的含量、GSH-PX活性也發生相應變化。SOD和GSH-PX作為內源活性氧清除劑，在高Cu的脅迫下能清除體內過量的氧自由基，使動物在一定程度上減緩逆境的脅迫[21,25]。但隨著Cu含量的繼續升高或脅迫時間的繼續延長，抗氧化酶的活性就會受到抑制，從而損傷細胞膜，降低生物的適應性[25]。

肝臟是Cu對魚類損害的主要靶器官，同時也是脂肪代謝的重要器官，通常最容易也最常見的變性就是脂肪變性。一般情況下，肝細胞胞漿內沒有脂肪滴，但如果胞漿內脂肪增多，出現一些不正常的脂肪滴或超過細胞所含脂肪滴的正常范圍，則會發生肝細胞脂肪變性[26]。在本實驗中，第Ⅴ組羅非魚肝臟在第20天時就出現了輕微的脂肪變性，之后脂肪變性逐漸加重。第Ⅲ組和第Ⅳ組分別在第60天和第40天時也出現了輕微的脂肪變性。在本實驗中，第Ⅳ、Ⅴ組在第20天時就出現細胞界限不清晰的現象，而第Ⅲ組在第40天時也出現了細胞界限模糊，有輕微核固縮的現象，其機制可能是由于Cu對細胞產生了毒性作用，抑制了細胞內酶的活性，使體內產生大量自由基，引發細胞膜的脂質過氧化作用，造成細胞的完整性受到破壞，細胞結構和功能受到影響。黃啟福[27]認為，如果有比較強烈的有害刺激或者細胞內壞境嚴重紊亂時，會導致部分生物體細胞或局部組織急劇死亡(局灶性壞死)，甚至整個肢體或器官壞死(全局性壞死)。在本實驗中，第Ⅴ組在40天時出現散在的局灶性壞死，而到第60天時，局灶性壞死現象加重，原因可能是Cu中毒時，大量的Cu首先聚集在肝細胞核、線粒體和肝漿液中，在肝細胞溶酶體內貯存，當溶酶體被破壞后，Cu和水解酶被釋放出來，損傷細胞結構，引起肝功能異常；如果肝臟從血液中吸收的Cu超過其貯存的限度，則可能抑制多種酶的活性，從而導致肝細胞變性、壞死[28]。

綜上，本實驗以吉富羅非魚為研究對象，分別在日糧中添加0、3、30、300、1 000、3 000 mg·kg-1Cu，研究了對其抗氧化功能、脂質過氧化和肝臟組織結構的影響，得出以下主要結論：(1)日糧Cu脅迫條件下，膜脂質過氧化產物MDA含量增加，羅非魚幼魚血清和肝臟中MDA的含量隨日糧中Cu含量的升高和脅迫時間的延長顯著升高，而SOD、GSH-PX和CuZn-SOD的活性表現出先升高后降低的趨勢，(2)隨著暴露時間的推移和日糧中Cu含量的升高，各組間肝臟表現出不同程度的病變，主要是濁腫變性和脂肪變性，試驗中第Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組均能觀測到較為嚴重的肝臟病變；(3)在本試驗條件下，吉富羅非魚幼魚日糧中Cu的實際含量不得高于42.36 mg·kg-1。

致謝：感謝廣東海洋大學動物科學系412實驗室全體同仁，以及廣東恒興集團湛江恒興水產科技有限公司、廣東吳川國聯羅非魚良種場對本試驗的支持。

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◆

Effects of Dietary Copper Stress on Antioxidation, Lipid Peroxidation and Tissue Structure of Liver in Juvenile GIFT Tilapia (Oreochromisniloticus)

Wang Wenlong1, Cui Xin1, An Lilong1,*, Xiao Mei2, #, Gao Han3, Li Chengcheng1, Xing Xing4, Li Yanwei1, Xu Yingmei1

1. Department of Animal Science, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China 2. Department of Animal Medicine, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China 3. Department of Pharmaceutics, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China 4. The People’s Republic of China Qinzhou Free Trade Port Area Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qinzhou 535008, China

16 Junuary 2015 accepted 17 March 2015

GIFT tilapia is an important economic species in aquaculture production in coastal regions in south of China, where is now facing an increasing challenge from Cu contamination with accelerated urbanization and industrialization. In order to evaluate the effects of dietary Cu stress on antioxidant activity and liver structure of juvenile GIFT tilapia, a total of 1 080 fishes were fed with 6 different concentrations of Cu in diets (0, 3, 30, 300, 1 000, 3 000 mg·kg-1) for 60 days. Antioxidation of serum and liver was measured, and the pathological changes of liver were observed. The results showed that the concentration of MDA in serum and liver increased significantly with exposure time and the increase of Cu accumulation in diets. Activities of SOD, CuZn-SOD and GSH-PX showed a down trend after a rise. Meanwhile, cloudy swelling and fatty degeneration in cells of liver was observed, especially pathological changes of liver aggravated when Cu concentration was increased to group Ⅲ, Ⅳ and Ⅴ. It could be concluded that dietary Cu stress depressed the antioxidant activity and damaged the liver of tilapia. Therefore, we suggest that Cu concentration in diets for juvenile tilapia should not be more than 42.36 mg·kg-1.

dietary copper stress; GIFT tilapia; pathological changes in liver; antioxidation; lipid peroxidation; cloudy swelling degeneration

廣東省科技計劃項目(2010B090400376)；國家級大學生創新創業訓練計劃項目(201310566005)

王文龍(1989-)，男，碩士，研究方向為動物營養與環境、生態毒理學，E-mail: wangwenlong2012@yeah.net；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: anlilong@126.com;

10.7524/AJE.1673-5897.20150116001

2015-1-16 錄用日期：2015-3-17

1673-5897(2015)2-266-10

X171.5

A

安立龍(1967-)，男，博士，教授，主要研究方向為動物營養與環境。

效梅(1965-)，女，教授，主要從事動物組織與胚胎工程的科研和教學工作。

# 共同通訊作者(Co-corresponding author)， E-mail: xiao0812@126.com

王文龍, 崔欣, 安立龍, 等. 日糧中銅脅迫對吉富羅非魚幼魚抗氧化、脂質過氧化及肝臟組織結構的影響[J]. 生態毒理學報, 2015, 10(2): 266-275

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