7種酚類化學物質對活性污泥的呼吸抑制作用

古文，周林軍，劉濟寧，石利利,*，陳國松

1. 環境保護部南京環境科學研究所，南京 210042 2. 南京工業大學 理學院，南京 210009

7種酚類化學物質對活性污泥的呼吸抑制作用

古文1,2，周林軍1，劉濟寧1，石利利1,*，陳國松2

1. 環境保護部南京環境科學研究所，南京 210042 2. 南京工業大學 理學院，南京 210009

苯酚類化學物質是廢水中常見的有機污染物，其對活性污泥的毒性數據對于污水處理廠穩定運行和化學品危害性評估具有重要意義。本研究采用活性污泥呼吸抑制試驗(209)測定7種酚類化學物質對活性污泥的呼吸抑制作用。結果顯示，2,6-二叔丁基苯酚和對特辛基苯酚對活性污泥未產生明顯的毒性效應；2,4-二氯酚、2-苯基苯酚、4-硝基酚、4-氯酚和對甲酚等5種化學物質都對活性污泥呼吸有不同程度的抑制效應，3 h-EC50值分別為49.7、77.6、102、150.1和462 mg·L-1，構效關系分析結果表明-Cl、-NO2等官能團是導致活性污泥呼吸抑制效應增強的關鍵因素。在化學品生物降解性測試研究中，要確保有毒化學物質的測試濃度低于EC50值的1/10。

酚類化學物質；活性污泥；呼吸抑制；毒性

化學品的大量使用在造福人類的同時，也給人與環境帶來了嚴重的危害。具有持久性、富集性和生物毒性的化學物質進入環境后，對自然生態系統包括微生物、無脊椎動物、脊椎動物等不同營養級物種造成不同程度的影響[1]。

有機化學品一般先隨廢水通過工業或生活污水處理廠的活性污泥工藝(activate sludge process, ASP)[2]進行生化處理，被活性污泥中的微生物降解和氧化，從而從污水中去除[3-4]。通常ASP能夠降解大多數易降解化學物質，從而顯著的降低化學物質在環境中的殘留濃度。但是有些化學物質會對活性污泥產生一定的毒性效應，如芳香類化學物質的存在會降低細菌細胞對碳源的生物利用，改變細胞膜的結構，從而引起系統溶解氧的降低[5]，以及污泥膨脹和降低泥水分離的效率，最終導致有機化合物的去除率下降和污水處理廠操作異常[6]。在化學品的風險評估中，生物降解性數據是評估化學物質持久性等危害特性的重要數據。生物降解測試之前應先開展化學物質對微生物的毒性評估，生物降解試驗中受試化學物質的濃度都應低于EC50的1/10，以確保其不會對接種物產生抑制效應，從而準確的評估化學物質的生物降解性。因此化學品對活性污泥的呼吸抑制毒性數據對于評估化學品的危害性具有重要意義。

為了評估化學品對活性污泥的呼吸抑制毒性效應，國內外研究人員采用了多種測定方法，如發光細菌試驗[7]、硝化抑制試驗[8]、呼吸抑制試驗[9]、微生物生長代謝測定以及酶活抑制[10]等。然而，生物發光試驗、微生物生長代謝試驗、酶活測定方法耗時耗材，且操作相對繁瑣，而活性污泥呼吸抑制試驗方法快速、可靠，并且成本低廉，能夠很好的評估化學品對活性污泥的毒性效應。

酚類化學物質廣泛用于印染、農藥、醫藥、石油化工[11-12]等行業，它們大都是芳香烴的羥基衍生物，是工業廢水中常見的有機污染物，具有原生質毒，對所有生物活性體均能產生毒性，有些甚至屬高毒物質，具有很強的抗降解能力和環境持久性[13]。近年來，氯代酚等多種酚類化學物質已被列入美國環保局(EPA)和中國環境保護部的優先污染物名單[14]。本文根據化學品測試方法209(活性污泥呼吸抑制試驗)[15]，選擇7種典型酚類化學物質測定對活性污泥的呼吸抑制毒性，并初步探討了對活性污泥的毒性機制。該研究為化學品的風險評估，尤其是對接種物的毒性和降解性評估提供了基礎數據和方法學參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

CR22GⅡ冷凍干燥離心機(HITACHI HIIMAC，日本)、MS105-DU電子天平(Mettle Toledo，瑞士)、曝氣泵(ACO-002，上海)、溶解氧-pH測定儀(HQ-40d，美國)、恒溫磁力攪拌器(國華，HJ-3)、純水儀(Milli-Q，美國)。

受試物信息：2-苯基苯酚(CAS：90-43-7，AR，百靈威化學)；4-硝基苯酚(CAS：100-02-7，AR，百靈威化學)；2,6-二叔丁基苯酚(CAS：128-39-2，AR，百靈威化學)；對特辛基苯酚(CAS：140-66-9，AR，百靈威化學)；對甲基苯酚(CAS：1319-77-3，AR，百靈威化學)；4-氯苯酚(CAS：106-48-9，AR，百靈威化學)；2,4-二氯苯酚(CAS：120-83-2，AR，百靈威化學)；參比物：3,5-二氯苯酚(CAS：591-35-5，AR，百靈威化學)。

活性污泥采自南京某污水處理廠曝氣池，活性污泥培養根據標準方法[15]。培養基組成為：蛋白胨16 g·L-1、牛肉浸膏11 g·L-1、尿素3 g·L-1、NaCl 0.7 g·L-1、CaCl2·2H2O 0.4 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1、K2HPO42.8 g·L-1。預處理的活性污泥懸浮液濃度為1 500 mg·L-1，在充氧條件下連續馴化24 h。

1.2 呼吸抑制測試

試驗中用1 L燒杯作為培養瓶，每只培養瓶添加一定濃度的酚類受試物，污泥懸浮液250 mL，合成污水16 mL，最后用去離子水定容至500 mL。此外，用2個不含受試物的培養瓶作為空白對照。試驗采用3,5-二氯苯酚作為參比物檢驗污泥的活性，參比物對照組中3,5-二氯苯酚濃度分別為3 mg·L-1、10 mg·L-1和30 mg·L-1。每只培養瓶用曝氣泵連續充氧曝氣3 h，3 h曝氣停止后迅速測量各個培養瓶內溶解氧的變化情況。

預試驗中各受試物的添加濃度分別為10 mg·L-1、100 mg·L-1和1 000 mg·L-1。如果預試驗結果EC50小于1 000 mg·L-1，則開展正式試驗。正式試驗中受試物濃度按照預試驗的EC50值設置，正式試驗中每個試驗濃度采用2個平行對照。

1.3 數據處理

(1)呼吸速率計算

活性污泥耗氧速率R按下列公式計算：

(1)

式中：R為活性污泥耗氧速率(mg O2·(L·h)-1)；Q1為氧氣吸收的上限值mg·L-1；Q2為氧氣吸收的下限值mg·L-1；Δt為2次測量的時間間隔(s)。

(2)抑制率計算

(2)

式中：I為抑制率，FA為受試物的呼吸速率，FB為空白對照的平均呼吸速率。

利用Origin8軟件以及Logistic方程推算受試物EC50。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 活性污泥活性檢驗

采用3,5-二氯苯酚作為參比物，檢驗活性污泥的活性及試驗條件的可靠性。圖1(a)為3,5-二氯苯酚的呼吸速率曲線，結果表明在15 min內隨著參比物濃度的增加，呼吸速率曲線變緩，呼吸速率下降。圖1(b)為3,5-二氯苯酚的劑量-效應曲線，3,5-二氯苯酚的EC50為16.0 mg·L-1，該值同Polo等

[16]測定的3,5-二氯苯酚EC50=14.2 mg·L-1相吻合。同時該值處于有效性標準2～25 mg·L-1[15]之間，表明活性污泥性能良好，可用于呼吸抑制毒性的測定。

2.2 酚類受試物對活性污泥的呼吸抑制影響

2.2.1 預試驗結果

預試驗中酚類受試物濃度分別為10、100、1 000 mg·L-1，7種物質對活性污泥的呼吸速率的結果見圖2。當濃度在10～1 000 mg·L-1的范圍內時，2,6-二叔丁基苯酚和對特辛基苯酚對污泥的呼吸并未產生明顯的抑制( 3 h-EC50>1 000 mg·L-1)。4-硝基苯酚、2-苯基苯酚、對甲酚、4-氯苯酚和2,4-二氯苯酚這5種物質隨著濃度的增高，污泥呼吸速率明顯下降，表明該5種物質對活性污泥具有不同程度的毒性。2,6-二叔丁基苯酚和對特辛基苯酚是白色片狀且難溶于水的固體，生物利用度很低，毒性效應也較低。2,6-二叔丁基苯酚是一種重要的酚類抗氧化劑，侯春生[17]發現蜂王漿中的2,6-二叔丁基苯酚能夠強烈的清除超氧自由基與對羥自由基，具有較低毒性，且對生物體具有抗衰老等特點，與本文研究結果一致。

2.2.2 正式試驗結果

對預試驗結果顯示有抑制效應的5種物質開展正式試驗，圖3顯示活性污泥暴露于不同濃度的酚類化學物質時溶解氧隨時間的變化情況。結果顯示，空白對照的溶解氧隨時間推移很快下降到最低值。由于采集的污泥為好氧活性污泥，微生物在其生存過程中要消耗大量氧氣，因此曝氣停止后，空白對照的溶解氧隨時間推移呈現有規律的下降。然而在添加酚類化學物質后，溶解氧隨時間下降的速率相比于空白對照變慢，并且隨著濃度升高呼吸速率更加緩慢，表明添加酚類化學品后，活性污泥內源呼吸逐步受到抑制，活性污泥呼吸速率逐漸減小，從而試驗體系中溶解氧消耗速率降低。當4-硝基苯酚的濃度達到800 mg·L-1時，溶解氧濃度在200 s之內幾乎停止下降，始終維持在9 mg O2·L-1，表明活性污泥的呼吸幾乎完全被抑制。Ho等[18]使用變性梯度凝膠電泳(DGGE)觀察到微生物多樣性隨著甲酚濃度增高而減少，并且通過測定酶活發現甲酚濃度超過100 mg·L-1以后，酶活性開始下降，從而導致甲酚降解性下降以及細胞增長速率的下降。

圖1 3,5-二氯苯酚溶解氧-時間變化曲線(a)和呼吸抑制率-濃度變化曲線(b)Fig. 1 (a) Curve of dissolved oxygen against the time for 3,5-di-chlorophenol; (b) Curve of respiration inhibition rate against the concentration of 3, 5-di-chlorophenol

圖2 預試驗中酚類化學物質濃度與活性污泥呼吸速率變化曲線Fig. 2 Curve of activated sludge respiration rate against the concentration of each phenolic chemicals during preliminary test

圖3 正式試驗中各酚類化學物質的溶解氧-時間變化曲線Fig. 3 The curves of dissolved oxygen against time for several phenolic chemicals during definitive test

酚類化學物質的呼吸抑制率隨濃度變化曲線見圖4，從圖中可見，5種酚類物質對活性污泥的呼吸抑制效應隨著濃度的增加而增加。表1為7種酚類受試物分別在預試驗和正式試驗中獲得的EC50數據，結合圖4可知各酚類物質的毒性從大到小順序依次為2, 4-二氯酚、2-苯基苯酚、4-硝基苯酚、4-氯酚和對甲酚，EC50分別為49.7、77.6、102、150.1和462 mg·L-1。

2.2.3 氯原子對毒性效應的影響

2,4-二氯酚對活性污泥的抑制效應( EC50=49.7 mg·L-1)明顯高于4-氯酚( EC50=150 mg·L-1)，可能是因為2,4-二氯酚容易比4-氯酚吸附于污泥，且更易于進入細胞膜。研究表明，活性污泥中的微生物細胞主要靠含大量水分的胞外聚合物質(EPS)保護從而不受外界有毒物侵害[9,19]，而EPS內親疏水基團的比例成為有機污染物吸附能力的關鍵[20-21]。對于酚類化學物質來說，通過電離以及未電離的形式擴散進入細胞膜速率的不同導致它們各自不同的毒性[22]。4-氯酚和2,4-二氯酚都是難溶

于水的化合物，具有一定的脂溶性，氯原子數量的不同導致其各自疏水性能的大小，最終影響著各自在細胞膜上的吸附、積累、界面傳輸以及與酶蛋白結合等過程，有機物脂溶性越強越易穿過細胞膜被吸附[23]，從而干預細胞內蛋白質，核酸以及部分酶的正常代謝，對活性污泥微生物產生較高的毒性。Chen等[3]研究發現2,4-二氯酚在1～20 mg·L-1時活性污泥的氧呼吸速率開始有了輕微減小，同時在添加較高濃度的2,4-二氯酚時，由于促使污泥產生較多的EPS，從而活性污泥的理化性質以及絮凝能力都受到影響。

2.2.4 暴露時間對毒性效應的影響

4-氯酚以及2, 4-二氯酚具有一定的揮發性，為了避免試驗過程中隨著時間延長而揮發損失，正式試驗中將暴露周期由原來的3 h調整為0.5 h，同時為了增加受試物同污泥的有效接觸，試驗前各個物質進行了加熱攪拌使其最大程度的溶解。從表1中可以發現2種物質正式試驗的EC50同預試驗結果都存在差異，表明暴露時間以及溫度的改變對物質的毒性有著直接的影響。

圖4 酚類化學物質的抑制率隨濃度變化曲線Fig. 4 The curve of respiration inhibition rate against the concentration of phenolic chemicals

表1 5種酚類化學物質的預試驗和正式試驗3 h-EC50和95%置信限Table 1 EC50 value and 95% confidence limit for phenolic chemicals during preliminary test and definitive test

2.2.5 呼吸抑制法與發光細菌法對EC50的影響

Polo等[12]使用OECD方法得出的4-氯酚在好氧條件下EC50是97 mg·L-1，使用發光細菌試驗的結果為1.9 mg·L-1。提出了氯酚類物質的毒性受到取代氯原子的位置和數量的影響這一規律。據報道當氯占據鄰位基團時，氯酚類物質的毒性會減小[24-25]。李娟英等[10]研究了2, 4-二氯酚對海水發光菌以及脫氫酶活性的抑制，結果表明2, 4-二氯酚對發光細菌EC50為4.95 mg·L-1，對脫氫酶活性的EC50為37 mg·L-1。分析可知，發光細菌試驗EC50與本文試驗結果相比偏小，可能是因為化學物質對單一菌群的抑制效應較混合菌群( 活性污泥)的抑制效應更為明顯。因此為了更準確、科學地判定污水處理廠中有機污染物的毒性，應當將發光細菌這一類生物同活性污泥聯立起來開展化學品毒性測試。

2.2.6 官能團對毒性效應的影響

本研究中7種苯酚類化學物質所含的官能團分別有-NO2、-Cl、-CH3、苯基、對特辛基、叔丁基和羥基。從研究結果可以看出，對特辛基、叔丁基和羥基幾乎不會對活性污泥存在抑制效應。4-硝基苯酚毒性效應( EC50=102 mg·L-1)稍大于4-氯酚( EC50=150 mg·L-1)，2種物質的分子結構差異僅在于-NO2和-Cl的差異，說明-NO2對微生物的毒性要高于-Cl。

微生物體內含有大量的酶，這些酶通常通過親電效應來與化學品發生結合或反應。當化學品分子上連接了-Cl、-Br、-NO2等取代基后，由于這些基團較強的吸電子效應，將會顯著降低酶的性狀和功能。常見的官能團中，按照吸電子能力強弱排序為：-SO3>-NO2>-Br>-Cl>-H>-NH2>-OCH3>-CH3>-COOH>-OH。因此，4-硝基苯酚、氯酚類化學品因含-NO2以及-Cl官能團，使得它們對微生物的毒性顯著增強，且毒性隨著取代基氯原子增加而變大。由于苯環上氯原子增多，導致正電性增強，因此氯代芳烴類化合物毒性一般較大[26]。此外，這些毒性基團的位置也對毒性效應有明顯的差別，毛明現和余訓民[27]認為氯離羥基越遠或者多個氯在羥基鄰位的同一側，則毒性越大。由于引入氯原子后化學物質的毒性明顯加大，故氯原子是影響芳烴化合物毒性的主要基團。

綜上，本研究采用209方法，評估7種酚類化學物質對活性污泥微生物的呼吸抑制效應。結果顯示5種酚類物質對微生物呼吸產生明顯的抑制。其毒性大小依次為2,4-二氯酚、2-苯基苯酚、4-硝基酚、4-氯酚和對甲酚，相應的EC50值分別為49.7、77.6、102、150.1和462 mg·L-1。研究表明化學物質對微生物的毒性會受到其結構、溶解度、官能團的親疏水性等因素影響。此外，本文中獲得的微生物毒性數據以及相關結論可以為化學品風險評估，特別是酚類化學品的生物降解性研究以及微生物毒性評價提供有效的建議和參考。

致謝：感謝環保部南京環境科學研究所石利利和劉濟寧老師在文章修改中給予的幫助。

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◆

Respiratory Inhibition Effect of Seven Phenolic Chemicals on Activated Sludge

Gu Wen1,2, Zhou Linjun1, Liu Jining1, Shi Lili1,*, Chen Guosong2

1. Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Nanjing 210042, China 2. College of Science, Nanjing Tech University, Nanjing 210009, China

17 November 2014 accepted 7 January 2015

Phenolic chemicals are ubiquitous organic contaminants in wastewater. The toxicity data of those compounds on activated sludge is of vital importance to steady operating of sewage treatment plant and performing of chemicals hazard assessment. In this study, respiratory inhibition effect of seven phenolic chemicals on activated sludge was tested by employing the activated sludge respiration inhibition test (TG 209). The experimental results indicated that there is no significant respiratory inhibition effect on activated sludge for 2,6-di-tert-butylphenol and 4-(1,1,3, 3-tetramethy(butyl)-phenol. However, significant respiratory inhibition effect on activated sludge was observed for other five tested phenolic chemicals i.e. 2,4-dichlorophenol, 2-phenyl-phenol, 4-nitrophenol, 4-chlorophenol and p-cresol. And their 3 h-EC50values were 49.7, 77.6, 102, 150.1 and 462 mg·L-1, respectively. The structure-activity relationship analysis results indicated that the functional groups such as -Cl, -NO2are key factors for strong inhibiting of activated sludge respiration. In addition, the results present here also imply that the tested concentration of those toxic compounds should be lower than 1/10 EC50in their biodegradability test.

phenolic chemicals; activated sludge; respiratory inhibition; toxicity

國家高技術研究發展計劃(863計劃)(No.2013AA060A308)；環保公益性行業科研專項經費(No. 2013467028)；中央級公益性科研院所基本科研業務專項(化學品污水處理廠暴露預測模型構建)

古文(1989-)，男，碩士，研究方向為化學品生態毒理評價，E-mail: guwen_1224@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: sll@nies.org

10.7524/AJE.1673-5897.20141117002

2014-11-17 錄用日期：2015-01-07

1673-5897(2015)2-276-07

X171.5

A

石利利(1966-)，女，碩士，研究員，主要從事化學品風險評估研究工作。

古文, 周林軍, 劉濟寧, 等. 7種酚類化學物質對活性污泥的呼吸抑制作用[J]. 生態毒理學報, 2015, 10(2): 276-282

Gu W, Zhou L J, Liu J N, et al. Respiratory inhibition effect of seven phenolic chemicals on activated sludge [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 276-282(in Chinese)