福美雙對斑馬魚胚胎III型脫碘酶基因表達的影響

于永利，陳形，李慧蕾，魏素香，楊景峰，張學富，東彥新，于華榮，楊文軍，董武,*

1. 內蒙古民族大學動物科技學院 內蒙古自治區高等學校毒物與動物疾病監控重點實驗室，通遼 028000 2. 內蒙古民族大學生命科學學院，通遼 028000 3. 內蒙古民族大學附屬醫院，通遼 028000 4. 百奧生生物科技公司，美國路易斯維爾 75057 5. 內蒙古民族大學農學院，通遼 028000

福美雙對斑馬魚胚胎III型脫碘酶基因表達的影響

于永利1,2，陳形1，李慧蕾3，魏素香4，楊景峰1，張學富1，東彥新1，于華榮5，楊文軍2，董武1,*

1. 內蒙古民族大學動物科技學院 內蒙古自治區高等學校毒物與動物疾病監控重點實驗室，通遼 028000 2. 內蒙古民族大學生命科學學院，通遼 028000 3. 內蒙古民族大學附屬醫院，通遼 028000 4. 百奧生生物科技公司，美國路易斯維爾 75057 5. 內蒙古民族大學農學院，通遼 028000

福美雙是一種二硫代甲氨基甲酸鹽類農藥，在我國應用較為廣泛，但其殘留毒性引起廣泛重視。試驗采用斑馬魚胚胎作為動物模型，探討了福美雙對斑馬魚胚胎的毒性。結果表明福美雙導致斑馬魚胚胎孵化率下降，在受精后72 h(72 hpf)，對照組的孵化率是100%, 1×10-7mol·L-1福美雙染毒組的孵化率降至46%，而1×10-6mol·L-1福美雙染毒致使孵化率降到0%。III型脫碘酶與斑馬魚的發育和變態息息相關，以上2種濃度的福美雙在24 hpf分別增高了III型脫碘酶基因的表達6.71和14.84倍，結果表明福美雙具有一定的內分泌攪亂作用，也表明斑馬魚胚胎作為農藥安全評價模型的理論可行性。

福美雙；斑馬魚；胚胎毒性；甲狀腺毒性；III型脫碘酶

福美雙(thiram)又名秋蘭姆，是二硫代氨基甲酸鹽類農藥的一種，廣泛應用于蔬菜、水果、植物等多種作物的病蟲害防治，屬低毒殺菌劑，但具有較高蓄積性[1]。2014年2月12日，美國環保署發布對福美雙(thiram)的殘留限量要求，規定草莓的福美雙殘留量不得超過20 ppm。一些國家甚至已經停止使用福美雙。

有關福美雙的毒性機制，國內學者有了一些報道，我們也對特異的脊索彎曲作了一些研究，但毒性機制還是不明了[2-4]。最近我們發現福美雙染毒引起色素沉著的變化，這與國外學者有關甲狀腺的研究結果存在一定關聯性，Marinovich等[5]報道乙撐二硫代氨基甲酸鹽(ethylenebisdithiocarbamates, EBDs)及其代謝產物(ethylenethiourea, ETU)影響甲狀腺球蛋白的作用而對甲狀腺有一定的毒性作用。體內的碘化甲狀腺球蛋白是碘的主要儲存形式，其被水解酶分解后可以生成較多四碘甲狀腺原氨酸(T4)，二型脫碘酶能夠T4轉換成具有極強生物活性的三型碘酪氨酸(T3)。T3在體內的含量的動態平衡對有機體的生長、代謝具有非常重要的影響。而T3的轉化滅活是由三型脫碘酶來完成的，即轉化成二碘甲狀腺原氨酸(T2)而失活達到調節的目的[6]。Freyberger等[7]也報道與ETU類似的四甲基硫脲(N,N,N',N'-tetramethylthiourea)引起大鼠甲狀腺的增生、肥大以及腫瘤的生成，其原因與甲狀腺素過氧化物酶和一型脫碘酶有關。

近年來，斑馬魚的胚胎毒性實驗廣受重視，因為斑馬魚胚胎已知基因較多、基因組計劃已基本完成、胚胎早期發育階段透明、可對發育過程直接觀察、生長速度快、短期內即可出結果、產卵較多，可提供大量測試樣本[8]。鑒于以上優點，以斑馬魚胚胎作為實驗動物模型，探討了乙撐二硫代氨基甲酸鹽類農藥福美雙對胚胎甲狀腺素三型脫碘酶的影響，從分子水平上探討了福美雙的毒性機制，為二硫代氨基甲酸鹽類農藥的安全毒性評價提供理論依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：尼康光學顯微鏡E600，尼康DXM 1200數碼相機，尼康EclipseNet圖像分析軟件(Nikon; Capture NX 2)，5415R型臺式離心機(Eppendorf公司)，定量PCR儀(Applied Biosystems, 7300 Real time PCR system)。

試劑：福美雙(Thiram T24201-100 g，純度97%(質量百分比)，二甲基亞砜(DMSO)溶液等其他藥物均來源于Sigma公司，純度≥99.5%(Sigma D-5879)。

1.2 實驗動物與染毒方法

斑馬魚(Danio rerio, AB系)，飼養于玻璃容器中，水溫28.5 ℃，光照周期為14 h·d-1。實驗前一天傍晚，取4條雌魚和8條雄魚混養。自然交配后，挑出發育正常的受精卵，受精后3 h(3 hpf)進行暴露實驗。實驗于直徑為3 cm的培養皿中進行。暴露濃度分別為：DMSO對照(0.1%)，1 × 10-9，1 × 10-8，1 × 10-7，1 × 10-6mol·L-1福美雙，每暴露濃度中含有10粒胚胎，每組進行3次平行實驗。染毒暴露開始后，將斑馬魚胚胎移入28.5 ℃ 孵化箱進行培養。福美雙暴露24 h后，換清水繼續培養至實驗所需的發育時間。固定清洗后用于原位雜交試驗。

1.3 原位雜交及其定位、定量分析

基本方法是按Dong等[9]描述的進行，固定后的斑馬魚使用蛋白酶K(10 μg·mL-1)室溫消化30 min，然后加入原位雜交液(50%甲酰胺，5 ×SSC，2 mg·mL-1Torula RNA，200 μg·mL-1肝素)放于67 ℃的恒溫加熱器中1 h(預雜交)，再用含有相關探針(3型脫碘酶)的原位雜交緩沖液中更換，放于恒溫加熱器中過夜。次日使用2 × SSC、0.2 × SSC在67 ℃加熱器中各清洗30 min，然后再用順丁烯二酸緩沖液(100 mmol·L-1順丁烯二酸，150 mmol·L-1NaCl，0.1%吐溫20，pH 7.5)清洗20 min，以及使用封閉液(blocking buffer: 2% blocking reagent，100 mmol·L-1順丁烯二酸，150 mmol·L-1NaCl，0.1%吐溫20，0.1% Trito x-100，pH 7.5)，之后固定清洗使用含有4 000倍稀釋的抗地高辛抗體(DIG, Roche)并置于4 ℃冰箱中反應過夜。在清洗液(NTMT: 100 mmol·L-1Tris-HCI，pH 9.5，100 mmol·L-1NaCl，50 mmol·L-1MgCI2，0.1 %吐溫20)中靜置20 min，使用BM purple AP substrate pre (Roche)發色觀察表達部位、范圍與強度等，對特定基因的表達定位，使用CCD攝像系統進行解析。

1.4 RNA的提取純化以及定量PCR (RT-PCR)技術

總RNA的制備將使用Trizol(Gibco產品)，使用手動或者勻漿儀打碎斑馬魚胚胎后者臟器后，加入氯仿并且離心，使之分為水相和有機相兩層。用移液槍轉移水相(內含有RNA)，用異丙醇沉淀RNA，經80%乙醇洗滌2遍后用水(RNase free)溶解。制備好的RNA樣品用核酸定量分析儀檢測OD260、OD260/OD280的值，并計算RNA產量。轉錄使用反轉錄酶2 μL，5× Buffer 4 μL，5 mmol·L-1dNTP 4 μL，反轉錄抑制劑1 μL，特異下游引物1 μL，模板5 μL，最后加DEPC水至20 μL。42 ℃、60 min后，在冰水中冷卻2 min備用。Sybr GreenI RT-PCR方法的建立：在25 μL反應體系中，加入sybr GreenI PCR反應混合液12.5 μL，上下游引物各2.5 μL，cDNA 7.5 μL(0.1 ng)。反應條件如下：95 ℃，10 min一個循環；然后95 ℃，15 s，60 ℃，1 min條件下反應40個循環。內參基因使用18 s，計算采用2-△△CT方法來計算基因表達的相對變化。

1.5 數據處理

試驗數據用SPSS統計軟件進行單因素方差分析方法進行多重比較，用平均值±標準誤差表示，差異顯著性水平設置為P<0.05。

2 結果(Results)

2.1 福美雙影響斑馬魚胚胎的孵化

從3 hpf給斑馬魚胚胎染毒福美雙，觀察其孵化率。當實驗持續到72 hpf時，對照組胚胎孵化率達到最大值，即100%，1× 10-9，1 × 10-8，1 × 10-7和1 × 10-6mol·L-1福美雙的孵化率分別是98%、97%、46%和0%進行各組孵化率的比較，對照組的孵化率顯著的高于1 × 10-7mol·L-1暴露組和1 × 10-6mol·L-1(P<0.05)。1 × 10-9和1 × 10-8mol·L-1福美雙對斑馬魚胚胎孵化率幾乎沒有影響，但1 × 10-7mol·L-1濃度的福美雙對孵化率有顯著的降低，至1 × 10-6mol·L-1濃度時沒有孵化。染毒組的孵化率隨著福美雙濃度的增加而明顯下降(圖1)。

圖1 斑馬魚胚胎的孵化率(72 hpf)Fig. 1 Hatching rate of zebrafish emryos at 72 hpf

2.2 福美雙對斑馬魚胚胎三型甲狀腺脫碘酶表達的影響

在甲狀腺素調節中，甲狀腺素脫碘酶是一種重要的酶類，其中脫碘酶I型和II型能夠使T4轉變成為有活性的T3，其中T3是一種重要的調節生長發育與生殖相關的激素。而III脫碘酶能夠使T3轉變成為T2，繼而使甲狀腺素失去活性。實驗克隆了斑馬魚甲狀腺素III型脫碘酶，并且進行了原位雜交試驗，發現III型脫碘酶主要表達在前腎管(圖2)，切片進一步觀察，發現III型脫碘酶在24 hpf主要表達在前腎管部位(圖2c)。使用原位雜交技術，確定基因的具體表達部位的同時，還具有一定的半定量功能，我們發現低濃度的福美雙(1×10-6mol·L-1)有輕微的增強III型甲狀腺素脫碘酶的表達(圖2B)。為進一步定量福美雙對III型脫碘酶的影響，試驗使用1×10-9，1×10-8，1×10-7，1×10-6mol·L-1福美雙給4 hpf斑馬魚胚胎染毒，直至24 h收集魚卵提取整體RNA，之后轉錄為cDNA，使用18s作為看家基因進行對比，發現III型脫碘酶基因表達與對照組相比較，分別增加了1.26(P>0.05)、4.49(P>0.05)、6.71(P<0.05)和14.84(P<0.05)倍 (圖3)，福美雙極顯著的增加了III型甲狀腺素酶的基因表達。

圖2 斑馬魚III型甲狀腺素脫碘酶基因表達注：A，對照組；B，福美雙1 × 10-9 mol·L-1； C是A中虛線部位的縱切圖片，紅色箭頭表示表示基因表達部位。Fig. 2 Diodinase III gene expression of zebrafish embryosNote: A, Control; B, Thiram 1×10-9 mol·L-1；C is a section of A in imaginary line, red arrow indicate the location of gene expression.

圖3 福美雙對斑馬魚胚胎III型甲狀腺素酶 基因表達的影響注：4 hpf的斑馬魚胚胎在1×10-9，1×10-8，1×10-7， 1×10-6 mol·L-1福美雙農藥終染毒至24 hpf，收集提取 RNA用于RT-PCR檢測。不同字母表示差異及顯著(P<0.05)。Fig. 3 Thiram affect Diodinase3 in zebrafish embryosNote: Zebrafish embryos were exposed to thiram (1×10-9, 1×10-8, 1×10-7and 1×10-6 mol·L-1) from 4 to 24 hpf, and analyzed by RT-PCR. Different letter indicate significant different (P<0.05).

3 討論(Discussion)

本實驗以斑馬魚作為實驗動物模型，使用不同濃度的福美雙給早期斑馬魚胚胎染毒，發現低濃度的福美雙顯著抑制了斑馬魚的孵化，這種抑制具有一定的濃度依存性，通過檢測與變態、生長發育有密切關系的III型甲狀腺素脫碘酶，以及原位雜交實驗驗探明基因在前腎管部位表達，進一步定量分析發現，福美雙極顯著的增高了III型甲狀腺素脫碘酶的基因表達，并且具有明確的濃度依存性。

福美雙是我國生產量較大，使用非常廣泛的一種低毒農藥，其廣泛大量的應用以及毒性蓄積作用，對人類的健康構成了潛在的威脅，各國對其的評價以及限制逐年深入與提高[1]。斑馬魚作為實驗動物模型具有非常快速、透明、費用低廉以及已知基因眾多的特點，是農藥評價不可多得的實驗模型。本試驗的染毒結果表明福美雙引起的胚胎孵化率低下以及三型甲狀腺素脫碘酶基因表達顯著升高具有密切的關聯性。孵化率的降低是生長與變態受到抑制的一種外在表現，而三型甲狀腺素脫碘酶能夠降解甲狀腺素(T3)，而使甲狀腺素失活，進而影響生長發育[10]。當去除III型甲狀腺素脫碘酶基因(Deiodinase knock out)，小鼠血清T3水平較高，尤其大腦組內的表達較高，引起后期的神經系統障礙和甲狀腺素機能減退[11-12]

福美雙的甲狀腺毒性，已有學者進行相關報道，如Flippin等[13]使用福美雙類混合物給23 d大鼠連續染毒4 d，發現此類農藥抑制了血清T4高達45%，有一定抗甲狀腺的作用，慢性中毒時可發生代償性甲狀腺腫大[14]。使用二硫代氨基甲酸酯類給大鼠染毒，可以明顯降低大鼠血液中的血清的T3、T4含量，動物有機體反饋會提高有機體內促甲狀腺素的含量，導致甲狀腺發生病變和甲狀腺增生。而本研究中III型甲狀腺素酶的增高也勢必引起T3的降低，表明最終結果具有一定的相似性[5]。此外，與福美雙同類別的代森鋅也能夠強烈抑制甲狀腺過氧化物酶的活性，從而干擾了甲狀腺激素的產生與合成[15]。Bhaskar與Mohanty報道與福美雙同類的代森錳(Mancozeb)能夠與T3競爭結合到甲狀腺素受體(THR)而使T3簡介失去活性[16]。本試驗中使用福每雙引起III型甲狀腺素脫碘酶升高也許是福美雙與THR的可逆/不可逆結合，讓有機體應急調節產生過量的III型甲狀腺素脫碘酶以用于消解過量的T3[16]。總之，實驗表明福美雙的胚胎毒性與甲狀腺系統有密切關聯。

綜上所述，我們所發現的福美雙導致斑馬魚胚胎孵化率下降，與引起III型脫碘酶表達的顯著提高有密切關系。從分子學角度探討福美雙的毒性機制，為食品安全及生態毒理學的研究提供一些理論基礎，對新農藥的開發、合理使用及安全評價具有一定的科學意義。

[1] 覃慧麗, 譚輝華, 李雪生, 等. 高效液相色譜法測定香蕉和土壤中福美雙的殘留量[J]. 農藥, 2013, 52(10): 740-742

Qin H L, Tan H H, Li X S, et al. Determination of thiram in banana and soil by HPLC [J]. Agrochemicals, 2013, 52(10): 740-742 (in Chinese)

[2] Teraoka H, Urakawa S, Nanba S, et al. Muscular contractions in the zebrafish embryo are necessary to reveal thiuram-induced notochord distortions [J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2006, 212(1): 24-34

[3] van Boxtel AL, Pieterse B, Cenijn P, et al. Dithiocarbamates induce craniofacial abnormalities and downregulate sox9a during zebrafish development [J]. Toxicological Sciences, 2010, 117(1): 209-217

[4] 于永利, 楊景峰, 董武, 等. 高殘留農藥福美雙對斑馬魚胚胎脊索的特異性影響[J]. 環境科學研究, 2011, 11: 1297-1304

Yu Y L, Yang J F, Dong W, et al. Specific effects of the highly-persistent pesticide thiuram on notochord development in zebrafish embryos [J]. Research of Enviromental Sciences, 2011, 11: 1297-1304 (in Chinese)

[5] Corsini E, Viviani B, Birindelli S, et al. Molecular mechanisms underlying mancozeb-induced inhibition of TNF-alpha production [J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2006, 212(2): 89-98

[6] Sutija M, Joss J M. Thyroid hormone deiodinases revisited: Insights from lungfish: A review [J]. Journal of Comparative Physiology B, 2006, 176(2): 87-92

[7] Freyberger A, Ahr H J. Studies on the goitrogenic mechanism of action of N,N,N',N'-tetramethylthiourea [J]. Toxicology, 2006, 217(2-3): 169-175

[8] Teraoka H, Dong W, Hiraga T. Zebrafish as a novel experimental model for developmental toxicology [J]. Congenit Anom (Kyoto), 2003, 43(2): 123-132

[9] Dong W, Teraoka H, Yamazaki K, et al. 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin toxicity in the zebrafish embryo: Local circulation failure in the dorsal midbrain is associated with increased apoptosis [J]. Toxicological Sciences, 2002, 69(1): 191-201

[10] Darras V M, Houbrechts A M, Van Herck S L. Intracellular thyroid hormone metabolism as a local regulator of nuclear thyroid hormone receptor-mediated impact on vertebrate development [J]. Biochimica et Biophysica Acta, 1849(2): 130-141

[11] Hernandez A, Martinez M E, Fiering S, et al. Type 3 deiodinase is critical for the maturation and function of the thyroid axis [J]. Journal of Clinical Investigation, 2006, 116(2): 476-484

[12] Sharlin D S, Visser T J, Forrest D. Developmental and cell-specific expression of thyroid hormone transporters in the mouse cochlea [J]. Endocrinology, 2011, 152 (12): 5053-5064

[13] Flippin J L, Hedge J M, DeVito M J, et al. Predictive modeling of a mixture of thyroid hormone disrupting chemicals that affect production and clearance of thyroxine [J]. International Journal of Toxicology, 2009, 28(5): 368-381

[14] Kackar R, Srivastava M K, Raizada R B. Studies on rat thyroid after oral administration of mancozeb: Morphological and biochemical evaluations [J]. Journal of Applied Toxicology, 1997, 17(6): 369-375

[15] Marinovich M, Guizzetti M, Ghilardi F, et al. Thyroid peroxidase as toxicity target for dithiocarbamates [J]. Archives of Toxicology, 1997, 71(8): 508-512

[16] Bhaskar R, Mohanty B. Pesticides in mixture disrupt metabolic regulation: In silico and in vivo analysis of cumulative toxicity of mancozeb and imidacloprid on body weight of mice [J]. General and Comparative Endocrinology, 2014, 205: 226-234

◆

Thiram Affects Diodinase3 Gene Expression in Zebrafish Embryos

Yu Yongli1,2, Chen Xing1, Li Huilei3, Wei Suxiang4, Yang Jingfeng1, Zhang Xuefu1, Dong Yanxin1, Yu Huarong5, Yang Wenjun2, Dong Wu1,*

1. Inner Mongolia Provincial Key Laboratory for Toxicants and Animal Disease, College of Animal Science and Technology, Inner Mongolia University for Nationalities, TongLiao 028042, China 2. College of Life Sciences, Inner Mongolia University for Nationalities, TongLiao 028000, China 3. Affiliated Hospital of Inner Mongolia University for Nationalities, TongLiao 028000, China 4. DNA Lab Department, Bio-Synthesis, Inc., Lewisville , TX 75057, USA 5. Agriculture Collage, Inner Mongolia University for Nationalities, TongLiao 028000, China

27 June 2014 accepted 20 August 2014

Thiram is a pesticide of the dithiocarbamate chemical family, and is extensively used in China. Its residual toxicity is a widespread problem and was voiced out by many members of the scientific community. In this study, zebrafish embryos were used as a whole animal model to understand thiram toxicity. Zebrafish embryos hatching rate was significantly decreased from 100% in control to 46% in 1×10-7mol·L-1thiram and even 0% in 1×10-6mol·L-1thiram. At the same time, significant increase in Deiodinase 3, an enzyme crucial in embryonic development and metamorphosis, was observed at 6.71 and 14.84 folds more than control at the two different concentrations at respectively at 24 hpf. These results demonstrated that zebrafish embryo is a sensitive model to thiram toxicity and can become a useful model for pesticide environmental toxicity assessment.

thiram; zebrafish; embryo toxicity; thyrotoxicity; diodinase 3

內蒙古自治區自然科學基金(2012MS1203; 2015MS0804)；國家自然科學基金項目(30360090；21267015)；內蒙古自治區“草原英才”工程(2014)

于永利(1978-)，男，講師，碩士，研究方向為食品與環境衛生學，E-mail: 707928940@qq.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: dongwu2002@hotmail.com

10.7524/AJE.1673-5897.20140627001

2014-06-27 錄用日期：2014-08-20

1673-5897(2015)2-320-05

X171.5

A

董武(1969-)，男，教授，獸醫學博士，碩士研究生導師，主要從事環境毒理學研究工作，發表學術論文30余篇。

于永利, 陳形, 李慧蕾, 等. 福美雙對斑馬魚胚胎III型脫碘酶基因表達的影響[J]. 生態毒理學報, 2015, 10(2): 320-324

Yu Y L, Chen X, Li H L, et al. Thiram affects Diodinase3 gene expression in zebrafish embryos [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 320-324 (in Chinese)