樂果對秀麗隱桿線蟲生活史特征的影響

王春花，李朝品，何梅

1. 安徽理工大學地球與環境學院，淮南 232001 2. 淮南師范學院生命科學系，淮南 232001

樂果對秀麗隱桿線蟲生活史特征的影響

王春花1,2，李朝品1,*，何梅2

1. 安徽理工大學地球與環境學院，淮南 232001 2. 淮南師范學院生命科學系，淮南 232001

采用一種半流體培養基“掛滴法”對線蟲進行培養和生命表實驗，研究了低劑量暴露下樂果對秀麗隱桿線蟲生活史特征的影響。在半致死濃度1/10 LC50、1/100 LC50、1/1000 LC50暴露劑量下(分別為7、0.7、0.07 mmol·L-1)染毒4 h。結果表明，0.7和7 mmol·L-1暴露組線蟲的總繁殖率(TFR)分別為260.60、203.80，明顯低于對照組(299.23，P<0.05)；凈增殖率(R0)分別為240.29、147.67，明顯低于對照組(298.67，P<0.05)；內稟增長率(rm)分別為1.342 d-1、1.233 d-1，明顯低于對照組(1.387 d-1，P<0.05)；而0.07 mmol·L-1暴露組線蟲的總繁殖率為293.84，凈增殖率為286.60，與對照組比差異都沒有統計學意義(P>0.05)。在上述濃度范圍，線蟲的總繁殖率(TFR)、凈增殖率(R0)和內稟增長率(rm)都隨樂果濃度的升高而降低，并存在劑量效應關系。研究同時發現0.07 mmol·L-1暴露組線蟲的內稟增長率為1.405 d-1，明顯高于對照組(P<0.05)。研究結論認為一定劑量的樂果使線蟲的繁殖力降低；而低劑量暴露則對內稟增長率具有毒物興奮效應。本文選擇的3個指標TFR、R0、rm對低劑量下樂果暴露的響應敏感。

樂果；秀麗隱桿線蟲；內稟增長率；總繁殖率；凈增殖率

線蟲是土壤生態系統中最豐富的動物，在水和沉積物環境也有大量發現，它們對生態系統的養分循環和在維護環境質量方面有許多重要作用，這些特性支持它們應用于生態毒理的監測和評估，從20世紀70年代后期，各種線蟲物種被開發并用來研究環境問題，在20世紀90年代末，秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)開始成為科學家們青睞的模式生物，現在秀麗隱桿線蟲是世界各地許多實驗室都在使用的模式生物，已經成功地應用于土壤與水環境中毒物毒性檢測與環境評估[1-3]。

樂果一種應用非常廣泛的有機磷殺蟲劑。Mauricio等[4]研究發現樂果能使小鼠的眨眼運動消失，小鼠的運動機能破壞，并影響小鼠的學習和記憶。Abdallah等[5]研究了樂果對雄性小鼠生殖系統的影響，結果表明樂果能引起雄鼠體重下降，睪丸和附睪及臟器系數極顯著增加，影響激素代謝，說明樂果還是一種環境激素類藥物，會干擾動物的生長發育、繁殖或激素的合成代謝。陳建秋等[6]研究了樂果對輪蟲生殖毒性，結果表明樂果對輪蟲有一定的生殖干擾作用，影響個體發育與性成熟時間、產卵量和后代量。Wilczeka等[7]研究表明樂果能使狼蛛腸腺體細胞凋亡或壞死程度增加。Cole等[8]檢測了樂果等10種有機磷農藥對秀麗隱桿線蟲染毒4 h的半致死濃度(LC50)和對乙酰膽堿酯酶(AChE)活性的影響，發現線蟲的LC50與小鼠的半數致死量(LD50)具有明顯的相關性，提出有機磷農藥對秀麗隱桿線蟲的影響可以用于指示它們對哺乳動物的神經毒性。

目前樂果對線蟲的毒性安全評價研究較少，對生活史特征的影響更是鮮有報道。本文將以模式生物秀麗隱桿線蟲為受試生物，檢測樂果的急性毒性，并在亞致死濃度下染毒線蟲，采用半流體培養基“掛滴法”進行生命表實驗，監測樂果對秀麗隱桿線蟲生活史特征的影響，以評價樂果對非靶生物的生態毒性，為利用秀麗隱桿線蟲監測環境污染提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

野生型秀麗隱桿線蟲N2由國際線蟲遺傳中心(Caenorhabditis Genetics Center，CGC)提供，樂果(C5H12NO3PS2，CAS: 60-51-5) Sigma公司產品，其他試劑均為生工生物工程股份有限公司產品。

1.2 線蟲的同步化處理

用M9(3.0 g·L-1KH2PO4，15.12 g·L-1Na2HPO4·12H2O)將發育至成蟲的線蟲從涂有大腸桿菌(E. coli OP50)NGM培養基(2.5 g·L-1Peptone，2.0 g·L-1Yeast extract，17 g·L-1Agar，3 g·L-1NaCl，5 mg·L-1膽固醇，25 mmol·L-1PBS，1 mmol·L-1MgSO4，1 mmol·L-1CaCl2)上洗下，加入到5 mL離心管中，使總體積達到2.8 mL，然后按順序加入0.8 mL次氯酸鈉溶液，0.4 mL 5 mol·L-1NaOH溶液，混勻，直至約2/3的蟲體裂解，以5 500 r·min-1離心，棄上清液，再以M9洗滌2遍，即可獲得發育中的受精卵，將制備的卵置于4 mL M9中過夜孵化，由于沒有添加食物，線蟲全部停留在L1期，將L1幼蟲接種于NGM上，即獲得同步化生長的個體。

1.3 急性毒性試驗

樂果分別溶解于含E. coli OP50的Km (53 mmol·L-1NaCl，32 mmol·L-1KCl)溶液中，使樂果最終濃度分別為：40、60、80、100 mmol·L-1，另外Km溶液作為對照組。線蟲放在24孔板中培養，每孔分別放置10條同步化的L4期線蟲，每組設3個平行孔，所有處理溫度均為20 ℃，處理后4 h，在解剖鏡下觀察，用鉑金絲針輕觸蟲體，沒有任何反應的即視為死亡個體，記錄死亡個體數目，實驗重復3次。根據概率單位法計算半致死濃度(LC50)。

1.4 生命表實驗

依據半致死濃度設定樂果的暴露劑量為1/10 LC50、1/100 LC50、1/1000 LC50(分別對應于7、0.7、0.07 mmol·L-1)，另設1組對照。不同濃度樂果染毒L4期線蟲4 h，Km洗3次，線蟲采用半流體培養基“掛滴法”進行培養，每個濃度3個12孔板(n0=36)。每12小時將親本線蟲轉到新的培養基上，每12小時觀察1次，每次觀察線蟲存活個體數，每條親本線蟲孵化出的幼體數，實驗至親本線蟲個體全部死亡后結束。所有的實驗操作都是在室溫下進行，室溫為(20±1) ℃，實驗重復3次。“掛滴法”由Daniel Muschiol在2009年首次提出應用在秀麗隱桿線蟲的生命表實驗中，此法采用一種半流體培養基[9]，在2011年，Brinke等[10]對其進行了改進，2種方法的培養基基本一致，只是Brinke等將這個配方分解分別配成3種溶液保存在冰箱內，現用現配，使用起來更加經濟方便。利用半流體培養基“掛滴法”進行培養的具體操作如下[10](略作修改)：第1步，半流體培養基的配制(用1.5 g·L-1結冷膠(Gellan gum)取代NGM中的瓊脂(Agar)，其他與NGM相同，滅菌后用磁力攪拌器邊冷卻邊攪拌，無菌操作)，E. coli OP50每2天準備1次，在線蟲換新鮮食物培養基時用重新懸浮。第2步，線蟲是放在培養板蓋子上培養的，新鮮食物懸液8 μL于12孔板蓋上，每滴1條線蟲，在12孔板每孔中放置1 cm左右吸足無菌水的疏松脫脂棉(使食物掛滴保持濕潤)，改好蓋子，用封口膜密封好放在20 ℃培養箱中培養。第3步，每12 h將親本線蟲轉到新的培養液滴中，之前的培養板放在培養箱中繼續培養過夜，待所有受精卵孵化后，將新孵化出的L1期幼蟲放在80 ℃熱蒸汽上熱處理1 min，然后用玫瑰紅染色液染色，蓋上蓋玻片，在體式顯微鏡下計數之前12小時親本所產的后代數量。

應用Microsoft Excel 2010根據公式對各生命表實驗所得數據對參數進行計算，計算公式如下：

x(age)：年齡，年齡時期(h)的分段；

lx(age-specific survival rate)：特定年齡存活率，lx= nx/n0；

mx(age-specific fecundity)：每一期每一存活個體生產的后代數，通過每天的實驗統計所得；

R0(net reproductive rate)：凈增殖率，表示種群在整個生命表中增長或下降的程度，R0=∑lxmx；

TFR(total fertility rate)：總繁殖率，TFR=∑mx；

T0/T1/T(alternative measures of generation time)：由于在年齡結構種群中世代時間的定義被認為武斷和不穩定，因此幾種不同的措施被Charlesworth等提出[11]，采用如下3個公式對世代時間進行對比。

T0=∑xlxmx/∑lxmx， T1=(lnR0)/rm， T=∑xe-rmxlxmx

rm(intrinsic rate of natural increase)：內稟增長率，根據Lotka方程，用代入法求得，方程如下:

1.5 數據處理分析

應用SPSS 17. 0軟件中的概率分析(Probit analysis)計算線蟲的半致死濃度LC50和95%可信限。采用單因素方差分析( one-way ANOVA)和Duncan檢驗法分析不同濃度樂果暴露對線蟲種群參數的影響，所有數據均表示為平均值±標準誤，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果(Results)

2.1 急性毒性實驗

急性毒性實驗結果顯示，樂果對秀麗隱桿線蟲的4 h半致死濃度LC50為(68.75±0.02) mmol·L-1(95%置信限度為60.17～78.48 mmol·L-1)

2.2 生命表參數

在不同濃度環境激素類農藥樂果中暴露4 h后，線蟲的生命表主要參數值如表1所示。對照組線蟲的總繁殖率(TFR)為299.23，而樂果暴露組線蟲的總繁殖率隨樂果濃度的增加而下降，呈現劑量效應關系，0.07 mmol·L-1暴露組(293.84)與對照組顯著不差異(P>0.05)，0.7 mmol·L-1暴露組(260.60)和7 mmol·L-1暴露組(203.80)與對照組差異顯著(P<0.05)。對照組的凈增殖率(R0)為298.67，而樂果暴露組的凈增殖率下降，隨濃度的增加依次為286.60、240.29和147，也呈現出明顯的劑量效應關系。世代時間各參數(T0/T1/T)的變化較復雜，沒有明顯的劑量效應關系。對照組線蟲的內稟增長率(rm)為1.387 d-1，樂果最低濃度暴露組(0.07 mmol·L-1)為1.405 d-1，明顯高于對照組；中濃度暴露組(0.7 mmol·L-1)為1.342 d-1，明顯低于對照組；而高濃度暴露組(7 mmol·L-1)為1.233 d-1，明顯低于中濃度處理組；樂果暴露組線蟲的內稟增長率同樣表現出明顯的劑量效應關系。

表1 在不同濃度樂果中暴露后線蟲生命表主要參數值Table 1 Demographic parameters of C. elegans after exposure to different concentrations of dimethoate

注： *表示與對照差異顯著(P<0.05)；TFR為總繁殖率，R0為凈增殖率，T0、T1、T為世代時間的替代措施，rm為內稟增長率。

Note: *represented there was a significant difference in comparing with control group. TFR is the total fertility rate, R0is the net reproductive rate, T0/T1/T is the alternative measures of generation time, rmis the intrinsic rate of natural increase.

圖1 不同濃度樂果暴露后線蟲的繁殖Fig. 1 Fecundity of C. elegans after exposure to different concetrations of dimethoate

2.3 樂果對線蟲繁殖率的影響

在不同濃度樂果中暴露后線蟲繁殖率的變化如圖1所示。從圖中可以看出，線蟲的總繁殖率(TFR)的最高值：對照組為309，0.07 mmol·L-1暴露組為296，0.7 mmol·L-1暴露組為272，7 mmol·L-1暴露組為212，總繁殖率的最高值暴露組明顯低于對照組。線蟲每天繁殖率的峰值：對照組為113，0.07 mmol·L-1暴露組為109，0.7 mmol·L-1暴露組為104，7 mmol·L-1暴露組為88，對照組的每天繁殖率的峰值明顯高于樂果暴露組。在實驗過程中發現樂果暴露組線蟲的排卵時間比對照組延遲2～4 h，而且整個排卵期縮短；還發現在樂果暴露組的線蟲出現了較多的卵在線蟲體內孵化的現象(如圖2所示)，而對照組很少發現。

圖2 線蟲卵在母體內孵化(10x20)Fig. 2 Juveniles of C. elegans hatched inside the body of their mother (10x20)

2.4 樂果對線蟲存活曲線的影響

線蟲的存活曲線(包括對照組和樂果暴露組)如圖3所示。急性中毒后，秀麗隱桿線蟲的每天存活率均明顯降低，對照組線蟲壽命最長的個體為33.5 d，0.07 mmol·L-1暴露組線蟲存活時間最長的個體為25 d，0.7 mmol·L-1暴露組線蟲存活時間最長的個體為19 d，而7 mmol·L-1暴露組線蟲壽命最長的個體為13.5 d。

圖3 不同濃度樂果暴露后線蟲存活曲線Fig. 3 Survivorship curves of C. elegans after exposure to different concetrations of dimethoate

3 討論(Discussion)

目前國內外有許多學者對秀麗隱桿線蟲進行了毒理學研究，但是研究指標主要在個體水平(死亡率，繁殖)、生理生化水平(體長、酶活、運動、攝食等)和基因水平(各種與脅迫有關基因的表達等)。種群水平毒理學研究卻鮮有報道，2009年Daniel Muschiol等[9]采用半流體培養基“hanging-drop”/“掛滴法”進行了生命周期(life cycle)實驗，對比了2種秀麗隱桿線蟲(N2，MY6)的凈增殖率(R0)、總繁殖率(TFR)、世代時間各參數(T0/T1/T)和內稟增長率(rm)。這種半流體食物培養基結合了液體和固體培養基的優點，完全適合生命表實驗，因為其粘度允許線蟲自由行動，同時又阻止細菌細胞積累在掛滴底部。這種方法允許單個個體在懸滴中進行培養，可以允許在任何所需的時間準確度上調查各種生活史特征，而且這種方法每次使用的培養基的量很少，在保證了精準度的同時節約了實驗資源，是一種經濟、簡單、快速而精確的方法。本研究中，在20 ℃下培養秀麗隱桿線蟲，56 h左右長到L4期，在第4次蛻皮后，大約65 h開始產卵，大約130 h(整個生活史的第5.5天左右)產卵高峰期結束，本研究對照組線蟲的生活史與1976年Byerly等[12]研究的秀麗線蟲生活史基本類似。1991年Hodgkin等[13]研究得出線蟲的總繁殖率TFR為327，2009年Muschiol等[9]研究得出的為295，本研究中對照組為299，介于兩者之間。本研究進一步肯定了該方法的可重復性和便利性。2011年Brinke等[10]利用這種半流體培養基檢測了伊佛霉素(ivermectin)、涕滅威(aldicarb)和鎘(cadmium)對Caenorhabditis elegans和Panagrolaimus cf. thienemanni兩種線蟲生長和繁殖的影響，同時與傳統液體染毒方法對比，證實半流體培養基非常適合亞致死濃度下線蟲的毒性檢測，并提出這種半流體培養基也適用于難溶或者不溶于水的物質(如納米材料)的毒性檢測。

生命表實驗是對污染物評估很有價值的實驗，根據線蟲的lx和mx2個指標可以估算出線蟲種群的內稟增長率(rm)是與生態有關的指標，可以反映出污染物對種群的影響。陳建秋等[6]提出萼花臂尾輪蟲與生命周期有關的各參數(如繁殖率、凈增殖率、世代時間等)可以用于檢測和評估污染物的毒性。2013年Brinke等[14]檢測了伊佛霉素(ivermectin)對秀麗隱桿線蟲生命周期特征的影響，證實線蟲的總繁殖率(TFR)，凈增殖率(R0)和種群內稟增長率(rm)可以用于污染物的毒性安全評價。在本研究中，樂果暴露組線蟲的內稟增長率(rm)、總繁殖率(TFR)和凈增殖率(R0)，隨著樂果濃度的增加，數值減小，且差異顯著，呈現劑量效應關系，表明這3個指標對低劑量下樂果暴露的響應敏感，可以利用秀麗隱桿線蟲對樂果的毒性進行檢測和評估。世代時間各參數(T0/T1/T)與前3個指標不同，沒有出現隨樂果濃度增加而規律性的變化，說明它不適用于樂果的毒性檢測和評估，Brinke等[10]研究同樣表明秀麗隱桿線蟲的參數T0/T1/T對伊佛霉素不敏感。陳曉雪等[15]在研究鎳對不同生命階段秀麗隱桿線蟲體長和運動的影響中，發現L3期線蟲的體長在低濃度受到刺激，在高濃度受到抑制，表現為毒物興奮效應。本研究發現，低濃度組內稟增長率(rm)為1.405 d-1，顯著大于對照組(1.387 d-1)，中濃度組和高濃度組(1.342 d-1，1.233 d-1)明顯低于對照組，表明樂果低劑量暴露對秀麗隱桿線蟲內稟增長率具有毒物興奮效應。同時本研究還表明較高劑量樂果即使短時暴露都會使線蟲種群的內稟增長率受到抑制，因此雖然樂果是易降解農藥，但是農藥噴灑后，遷移到土壤中的樂果對土壤系統中非靶生物的影響也是不能忽視。

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◆

Effects of Dimethoate on Life-cycle Traits ofCaenorhabditiselegans

Wang Chunhua1,2, Li Chaopin1,*, He Mei2

1. College of Earth and Environmental Science, Anhui University of Science &Technology, Huainan 232001, China 2. Department of Life Science, Huainan Normal University, Huainan 232001, China

27 September 2014 accepted 19 November 2014

A hanging-drop method with a semi-fluid culture medium was used to carry out life table experiments in order to test the toxic effects of dimethoate on life-cycle traits of Caenorhabditis elegans, after the nematodes were exposed to three groups of dimethoate (0.07, 0.7 and 7 mmol·L-1, which were 1/1000 LC50, 1/100 LC50and 1/10 LC50respectively) for 4 h. The results showed that in 0.7 and 7 mmol·L-1groups, the total fertility rates (TFR) of nematodes were 260.60 and 203.80 respectively, both of which decreased significantly compared with control (299.23, P<0.05); the net reproductive rates (R0) were 240.29 and 147.67, which dropped significantly compared with control (298.67, P<0.05); the intrinsic rates of natural increase (rm) were 1.342 d-1and 1.233 d-1, which were much lower than control (1.387 d-1, P<0.05); while in 0.07 mmol·L-1group, TFR was 293.84, and R0was 286.60，the differences of which were not statistically significant (P>0.05). In the scope of the above dimethoate concentration, the values of TFR, R0and rmall decreased evidently as the concentration of dimethoate increased. The study also found that the rmin 0.07 mmol·L-1group was 1.405 d-1, which was evidently higher than control (P<0.05). From the present study, it was concluded that the fertility of C. elegans decreased when exposed to the dimethoate in a specific amount, while low doses of dimethoate had a hormesis effect on intrinsic rate of natural increase (rm) of nematode population, and the three parameters of TFR, R0and rmdetected in this paper were sensitive to dimethoate exposure in low dosage.

dimethoate; Caenorhabditis elegans; intrinsic rate of natural increase；total fertility rate; net reproductive rate

安徽高校省級自然科學研究項目(KJ2012Z380)

王春花(1979-)，女，博士，研究方向為環境與健康，E-mail: ch_wang03@aliyun.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: 13805536665@126.com

10.7524/AJE.1673-5897.20140927001

2014-09-27 錄用日期：2014-11-19

1673-5897(2015)2-332-06

X171.5

A

李朝品(1956-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事環境與健康的研究。

王春花, 李朝品, 何梅. 樂果對秀麗隱桿線蟲生活史特征的影響[J]. 生態毒理學報, 2015, 10(2): 332-337

Wang C H, Li C P, He M. Effects of dimethoate on life-cycle traits of Caenorhabditis elegans [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 332-337 (in Chinese)