空心蓮子草醇提物對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的防護(hù)作用＊

閻納新，武謙虎

(1.河北省石家莊市第五醫(yī)院，河北 石家莊 050021;2.江蘇省鎮(zhèn)江市第三人民醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212000)

空心蓮子草曾收載于1997年版《中國(guó)藥典(一部)》，具有清熱解毒、涼血利尿的功效，臨床可用于病毒性肝炎的治療[1－5]。筆者采用空心蓮子草醇提物對(duì)小鼠酒精性肝損傷的防護(hù)作用進(jìn)行了試驗(yàn)研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

藥物與試劑:空心蓮子草醇提物(自制)，空心蓮子草原藥材采自江蘇鎮(zhèn)江，經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定為莧科植物空心蓮子草 Alternanthera philoxeroides(Mart.)Griseb的全草;北京紅星二鍋頭白酒(簡(jiǎn)稱白酒，乙醇體積分?jǐn)?shù)為56%，北京紅星股份有限公司，批號(hào)為1435342);注射用還原型谷胱甘肽鈉(商品名古拉定，積華藥業(yè)有限公司，批號(hào)為5038);血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)與天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒均由南京建成生物研究所提供。動(dòng)物:60只KM小鼠，雌雄各半，體重(25.0±2.0)g，飼養(yǎng)溫度為18～20℃，自由攝食及飲水，動(dòng)物合格證號(hào)為Syxk(蘇)2013－0036，江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。儀器:Synchon CX9 PRO型全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)貝克曼公司)。

1.2 方法

空心蓮子草提取物的制備:取空心蓮子草干品500 g，粉碎成粗粉，加70%乙醇適量浸泡12 h，滲漉，收集滲漉液，回收乙醇后，加蒸餾水至 500 mL(1.0 g∶1.0 mL)，裝入 100 mL 瓶中高壓滅菌，備用。

酒精性肝損傷模型的制備:采用白酒(含乙醇56%)經(jīng)口一次性給予小鼠(灌胃量相當(dāng)于每10 g體重0.14 mL)，連續(xù)7 d。

動(dòng)物分組與給藥:將60只KM小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(A組)，模型組(B組)，陽(yáng)性對(duì)照組(C組)，空心蓮子草醇提物高、中、低劑量組(D1，D2，D3組)6組，各 10只，雌雄各半，按鼠體重給藥。A組與 B組給予 0.09 g/(g·d)的氯化鈉溶液(9.0 g/L)0.01 mL灌胃;D1，D2，D3組分別給予相當(dāng)于空心蓮子草生藥4.00 ×10－3，2.00 ×10－3，1.00 ×10－3g/(g·d)的空心蓮子草醇提物灌胃;C組給予注射用還原型谷胱甘肽鈉0.30×10－3g/(g·d)灌胃。除A組外，其余各組給藥1 h后再給予每只小鼠(0.014 mL/g)白酒灌胃，共連續(xù)灌胃7 d，最后1次給藥后只進(jìn)水。末次給藥12 h后，行小鼠眼球摘取取血，將血標(biāo)本離心，取血清測(cè)定ALT及AST值;同時(shí)，盡快解剖小鼠以獲取新鮮肝臟，并放置10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋切片，HE染色，在光學(xué)顯微鏡(×200)下觀察病理組織學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以X±s表示，行 t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察指標(biāo)

結(jié)果見(jiàn)表1。

X ± s，n=10)

表1 6組小鼠觀察指標(biāo)比較(

2.2 肝臟組織病理學(xué)變化

A組肝組織基本結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞呈球形。胞核圓，染色較淺，核仁明顯，核膜清晰，核周間隙及核質(zhì)均勻;胞質(zhì)富含較多細(xì)胞器及內(nèi)含物，無(wú)脂滴空泡，線粒體結(jié)構(gòu)正常，其中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)常在核周及線粒體周圍成群分布，平行排列，見(jiàn)圖1 A。B組肝組織基本結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，細(xì)胞排列紊亂，肝細(xì)胞腫脹，片狀壞死多見(jiàn)，肝中央靜脈可見(jiàn);胞核不規(guī)則，胞質(zhì)可見(jiàn)數(shù)目較多脂滴空泡，見(jiàn)圖1 B。C組肝組織基本結(jié)構(gòu)可見(jiàn)，細(xì)胞大小尚均一，排列整齊，部分肝細(xì)胞水腫，伴少許變性，壞死病灶不多見(jiàn)，肝中央靜脈明顯，胞質(zhì)可見(jiàn)少量脂滴空泡和溶酶體，同B組比較，明顯減輕，見(jiàn)圖1 C。D3組肝組織基本結(jié)構(gòu)可見(jiàn)，細(xì)胞排列尚整齊，一部分細(xì)胞可見(jiàn)輕度水腫與脂肪變性，小膽管周圍有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞可有點(diǎn)片狀壞死，胞質(zhì)病變可見(jiàn)少數(shù)線粒體存在腫脹變形，脂滴空泡和溶酶體較B組少，見(jiàn)圖1 D。D1及D2組肝組織基本結(jié)構(gòu)可見(jiàn)，細(xì)胞大小尚均一，排列整齊，肝中央靜脈清楚可見(jiàn)，部分肝細(xì)胞水腫，幾乎無(wú)壞死病灶，偶可見(jiàn)少許變性。胞質(zhì)可見(jiàn)少量脂滴空泡及溶酶體，與B組比較，明顯減輕，見(jiàn)圖1 E和圖1 F。

3 討論

酒精中毒引起的肝損傷主要由酒精代謝產(chǎn)物乙醛所致[6]。本試驗(yàn)中采用一次性灌胃給予小鼠每10 g體重0.14 mL乙醇體積分?jǐn)?shù)為56%的白酒制作肝損傷模型，該方法簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)、易于操作且小鼠的死亡率較低。

圖1 小鼠肝臟組織病理學(xué)變化(HE，×200)

ALT和AST為監(jiān)測(cè)肝細(xì)胞損害臨床常用的敏感指標(biāo)，當(dāng)肝組織出現(xiàn)損傷時(shí)，肝細(xì)胞能量障礙，血清中ALT和AST升高，一定程度上可由其水平推測(cè)肝細(xì)胞壞死和損傷程度[7]。當(dāng)人體攝入過(guò)量乙醇后，肝臟為主要代謝臟器，但乙醇在損傷肝臟細(xì)胞同時(shí)會(huì)損傷肝臟毛細(xì)膽管，因此會(huì)同時(shí)出現(xiàn)肝細(xì)胞和毛細(xì)膽管炎癥，此時(shí)血中另一種γ－谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶會(huì)明顯升高[1，8－9]。本研究結(jié)果顯示，空心蓮子草醇提物各劑量藥及陽(yáng)性對(duì)照藥均可有效降低酒精性肝損傷小鼠血清ALT和AST水平(P＜0.05);病理組織學(xué)檢查顯示，空心蓮子草醇提物對(duì)小葉中心性纖維化、小葉中心性小灶性壞死及點(diǎn)狀壞死均有改善作用。因此，空心蓮子草醇提物在血清酶學(xué)和組織學(xué)方面均顯示出對(duì)酒精誘導(dǎo)肝損傷的防護(hù)作用，進(jìn)一步為現(xiàn)代工藝提取傳統(tǒng)方藥中有效物質(zhì)指明了方向。

Lieber等[10]的研究顯示，乙醇可增加肝細(xì)胞內(nèi)自由基的生成，包括氧自由基、羥自由基等。自由基則會(huì)激活磷脂酶，引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，增加過(guò)氧化終產(chǎn)物丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)的生成，但抑制肝臟內(nèi)抗氧化劑的產(chǎn)生，如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH－Px)等，聯(lián)合檢測(cè) SOD和MDA可評(píng)估自由基攻擊肝細(xì)胞的嚴(yán)重度，也進(jìn)一步反映機(jī)體對(duì)氧自由基的清除能力[11]。本研究中，白酒造模的小鼠肝組織MDA含量顯著增加，而SOD含量明顯降低，病理學(xué)檢查示肝細(xì)胞存在明顯損傷，同相關(guān)報(bào)道一致，即肝損傷上述變化同脂質(zhì)過(guò)氧化密切相關(guān)。對(duì)模型小鼠灌注空心蓮子草醇提物后，肝組織MDA含量有效降低，而SOD含量有效提升，病理學(xué)檢查示肝臟損傷明顯改善，呈現(xiàn)出劑量依賴態(tài)勢(shì)，表明空心蓮子草醇提物能有效抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，保持細(xì)胞質(zhì)膜正常，進(jìn)一步表明其可清除自由基，減少其對(duì)細(xì)胞的損害作用。因此，空心蓮子草抗酒精性肝損害作用機(jī)制可能與其抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用有關(guān)，為空心蓮子草用于治療酒精性肝病提供了部分理論依據(jù)。

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