超高效及高效液相色譜法測定華法林鈉片含量的結果比對

丁大中，宋梓瑜，于 毓

(山東省青島市食品藥品檢驗檢測中心，山東 青島 266071)

華法林鈉為雙香豆素的衍生物，臨床應用廣泛，其優點是作用強且穩定、可口服給藥、應用方便、價廉且作用持久[1－2]。目前，進口華法林鈉片采用《國家食品藥品監督管理局進口藥品注冊標準》[3]檢驗，含量測定采用高效液相色譜(HPLC)法。超高效液相色譜(UPLC)法比HPLC法具有高效、快速、靈敏度和分辨率高、微量、經濟及環境友好等優點[4－8]，但將其用于華法林鈉含量測定還未見報道。本研究參考文獻[9－12]，成功建立了測定華法林鈉片含量的UPLC法，該方法操作靈敏、準確，且能實現高通量的分析樣品。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司);Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀(包含Empower色譜工作站，美國Waters公司);AG285型十萬分之一天平(瑞士 Mettler Toledo公司);超純水儀(美國Millipore公司)。華法林鈉對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號為101163－201001，含量為92.3%);磷酸(天津市科密歐化學試劑有限公司，批號為20120104)、甲醇(德國Merch公司)、乙腈(德國Merch公司)均為色譜純;超純水(Millipore超純水儀公司);華法林鈉片(芬蘭Orion Corparation公司，規格為每片 3 mg，批號分別為 1555638，1555639，1556716，1556720，1556722)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

HPLC色譜條件:色譜柱為Agilent Zorbax SB－C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);以水(磷酸調 pH 至 3.0)為流動相 A、乙腈為流動相B，進行梯度洗脫;流速1.5 mL/min;柱溫30℃;檢測波長280 nm;進樣量 20 μL。

UPLC色譜條件:色譜柱為Thermo Syncronis C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7μm);以水(磷酸調 pH 至 3.0)為流動相 A、乙腈為流動相B，進行梯度洗脫;流速0.5 mL/min;柱溫30℃;檢測波長280 nm;進樣量5 μL。梯度洗脫方法見表1。

2.2 溶液制備

精密稱取華法林鈉對照品10 mg，置100 mL容量瓶中，加溶劑A(水∶乙腈=2∶8)振搖溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液(100 μg/mL)。取華法林鈉片20片，精密稱定總質量，研細，精密稱取細粉(約相當于華法林鈉5 mg)，置50 mL容量瓶中，加溶劑A適量，超聲10 min使溶解并稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液作為供試品溶液(100 μg/mL)。

表1 HPLC法與UPLC法梯度洗脫方法

2.3 UPLC方法學考察

線性關系考察:精密吸取 2.2 項下對照品溶液 3，4，5，6，8 μL，注入超高效液相色譜儀，按UPLC色譜條件進樣測定。以樣品峰面積(Y)為縱坐標、進樣量(X，μg)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y=4.36×106X －1.53×104，r=0.999 8(n=5)。結果，華法林鈉進樣量在0.284～0.758 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

最低檢測限確定:以信噪比為3∶1(S/N=3)的濃度進樣，華法林鈉的最低檢測限為0.02 ng。

精密度試驗:取2.2項下同一對照品溶液，連續進樣6次。結果華法林鈉保留時間的 RSD為 0.06%，峰面積的 RSD為0.08%(n=6)，表明儀器精密度良好。

重復性試驗:精密稱取同一批(批號為1555638)樣品粉末6份，制備供試品溶液，按UPLC色譜條件進樣測定。結果的 RSD為0.28%(n=6)，表明方法重復性良好。

穩定性試驗:取2.2項下制備的同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，16，24 h按擬定色譜條件依法進樣 6次。結果峰面積的RSD為0.21%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內穩定。

加樣回收試驗:精密稱取半量已知含量的同一批(批號為1555638)樣品細粉9份，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別精密加入0.51 g/L華法林鈉對照品溶液，稀釋至刻度，搖勻，依法進樣測定，計算回收率。結果見表2。

表2 華法林鈉加樣回收試驗結果(n=9)

系統適用性試驗:精密稱取4－羥基香豆素和(E)－4－苯基－3－丁烯－2－酮對照品各10 mg，置100 mL容量瓶中，加溶劑A溶解，精密量取1 mL，置100 mL容量瓶中，精密加入2.2項下供試品溶液5 mL，加溶劑A溶解，精密量取5 mL置500 mL容量瓶中，加溶劑A稀釋至刻度，即得供試品溶液。各組分的洗脫順序為4－羥基香豆素、(E)－4－苯基－3－丁烯－2－酮和華法林鈉，前兩者峰的分離度應不小于2.5。結果及色譜圖見表3和圖1。

表3 HPLC法與UPLC法系統適用性試驗結果對比

圖1 系統適用性試驗色譜圖

2.4 樣品含量測定

取5批樣品，按2.2項下方法分別制備對照品和供試品溶液，分別按2.1項下HPLC和UPLC色譜條件進樣測定，用外標法以峰面積計算含量。結果表明，在UPLC色譜條件下，華法林鈉峰形良好，與雜質峰的分離度高，且UPLC和HPLC方法所得結果一致，見表4。HPLC法與UPLC法中華法林鈉對照品與供試品的典型色譜圖見圖2。

表4 UPLC法和HPLC法含量測定結果對比(n=5)

圖2 典型色譜圖

3 討論

梯度洗脫方法優化:原標準中HPLC法梯度洗脫時間為50min，流速為1.5 mL/min，時間長，流速大，消耗大量有機溶劑。采用UPLC 法將洗脫時間縮短至 12.5 min，流速降至 0.5 mL/min，時間和流速均減少了70%以上，實現快速測定含量，同時減少溶劑消耗量，極大地降低了成本，減少了環境污染。

流速選擇:本研究中嘗試了多種流速后發現，流速小時，華法林鈉出峰時間長，使梯度洗脫時間過長，達不到快速分離的目的;流速大時，系統和色譜柱反壓過大，無法正常分析樣品;最后確定流速為0.5 mL/min，在系統可承受壓力范圍內和在保證分離效果的前提下，盡可能地縮短了梯度洗脫時間。

進樣量選擇:試驗確定了方法的線性范圍，并對系統精密度、重復性、穩定性和回收率進行了考察，結果顯示，進樣量小會降低方法的精密度和重復性，進樣量大會超出線性范圍，出現過載現象。最終確定了進樣為5 μL。

系統適用性試驗:由結果可見，2種方法均能良好地達到標準規定的要求，但UPLC法峰形更好，各組分間的分離度更優。

本研究中建立的UPLC法相比HPLC法用于華法林鈉片的含量測定，具有檢測效率高、靈敏度好、準確快速且綠色環保的優點，并可推廣用于華法林鈉其他制劑的含量測定。

[1]張石革，馬國輝，臧 靖.抗血栓藥華法林鈉的進展與合理應用[J].中國全科醫學，2005，8(20):1 680.

[2]鄭必龍，劉 俊.華法林抗凝血作用及影響因素分析[J].安徽醫藥，2013，17(11):1 975 －1 977.

[3]JX20120121，國家食品藥品監督管理局進口藥品注冊標準[S].

[4]Wirth MJ.Mass transport in sub－2－μm high－performance liquid chromatography[J].J Chromatogr A，2007，1 148(1):128.

[5]楊義芳.超高效/高分離度快速/超快速液相色譜在中藥及其制劑研究中的應用[J].中草藥，2008(8):1 259.

[6]陳 佳，王鋼力，姚令文，等.超高效液相色譜(UPLC)在藥物分析領域中的應用[J].藥物分析雜志，2008，28(11):1 976 －1 981.

[7]張承軍，王秀梅，王建良，等.UPLC法測定生長抑素原料藥的含量[J].西部中醫藥，2012，25(10):37－40.

[8]Gumustas M，Kurbanoglu S，Uslu B，et al.UPLC versus HPLC on drug analysis:advantageous，applications and their validation paramaters[J].Chromatographia，2013，76(21 －22):1 365 －1 427.

[9]王 慧，況 剛，封海霞，等.高效和超高效液相色譜法測定樂脈丸中丹酚酸B含量的比較[J].中國藥業，2012，21(22):53－54.

[10]謝新民，劉志剛，黃雪峰，等.高效液相色譜法測定鹽酸普萘洛爾乳膏的含量[J].中國藥業，2015，24(3):23 －24.

[11]李 霞，李 繼，戴 涌，等.高效液相色譜法測定復方甘草麻黃堿片中鹽酸麻黃堿含量[J].中國藥業，2015，24(1):43－44.

[12]逯小萌.高效液相色譜法測定氨糖美辛腸溶片中吲哚美辛含量[J].中國藥業，2014，23(24):74 －75