高效液相色譜法測定知柏地黃丸中3種成分含量

毛愛麗

(河南省鶴壁市食品藥品檢驗所，河南 鶴壁 458030)

知柏地黃丸由熟地黃、山茱萸、山藥、牡丹皮、澤瀉、茯苓、知母、黃柏8味藥材組方[1]，具有滋陰降火之功效，臨床用于治療陰虛火旺、潮熱盜汗、口干咽痛、耳鳴遺精、小便短赤等證。其成分復雜，質量較難控制，且質量標準中只有馬錢苷、丹皮酚的含量測定，而無君藥黃柏中鹽酸小檗堿的含量測定。為保證藥品質量，本研究中建立了同時測定知柏地黃丸中馬錢苷、鹽酸小檗堿、丹皮酚3種成分含量的高效液相色譜法，現報道如下。

1 儀器與試藥

UltiMate 3000型高效液相色譜儀(美國戴安公司);UV－240型分光光度計(日本島津公司);pHS－3C型精密酸度計(上海電光器件廠);AE 240型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。知柏地黃丸(市售，用粉碎機粉碎處理);鹽酸小檗堿對照品(批號為110713－200911，按 C20H18ClNO4計，含量為 86.8%，使用前不需處理)，丹皮酚對照品(批號為110708－200506，使用前不需處理)，馬錢苷對照品(批號為 111640－201005，含量為 99.2%，置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h)，均購自中國食品藥品檢定研究院;乙腈、甲醇、三乙胺均為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:DiamonsilTM(鉆石)C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相A為乙腈，B為磷酸鹽緩沖液[0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液和 0.05 mol/L庚烷磺酸鈉溶液(1∶1)，含 0.2%三乙胺，并用磷酸調 pH 至 3.0][2]，梯度洗脫(0～10 min，A 為 12% ，B 為88%;10～11 min，12%A→40%A，88%B→60%B;11～25 min，A為 40%，B 為 60%;25～26 min，40%A→12%A，60%B→88%B;26～29 min，A 為 12%，B 為 88%);流速:1.000 mL/min;檢測波長:230 nm;柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL。

2.2 溶液制備

精密稱取對照品鹽酸小檗堿25.58 mg、丹皮酚49.96 mg、馬錢苷25.36 mg，置同一50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密稱取知柏地黃丸1.000 g，精密加入甲醇50 mL，加熱回流15 min，置室溫，補足減失的質量，搖勻，經微孔濾膜過濾，取續濾液，即得供試品溶液。取缺黃柏、牡丹皮、山茱萸(制)的陰性樣品1.000 g，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 方法學考察

專屬性試驗:按擬訂色譜條件，分別取2.2項下3種溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，依法測定。結果供試品溶液色譜中，在與鹽酸小檗堿、丹皮酚和馬錢苷對照品溶液色譜相同保留時間處均出現相同的色譜峰，陰性對照品溶液色譜中則無此峰(見圖1)。馬錢苷保留時間為7.387 min，鹽酸小檗堿為18.067 min，丹皮酚為21.273 min，峰分離度均大于3，理論板數均大于3 000。

線性關系考察:精密量取對照品貯備液，稀釋成含鹽酸小檗堿 為 1.776 3，2.664 4，4.440 7，8.881 4，13.322，17.762 7，26.644 1，35.525 4，44.41 μg/mL，丹皮酚為 19.984，29.976，39.968，59.952，79.936，99.92，119.904 μg/mL，馬錢苷為 1.006 2，2.012 4，3.018 6，5.031，10.062，15.093，20.124，30.186，40.248，50.31 μg/mL 的系列混合對照品溶液。分別各精密吸取10 μL，按擬訂色譜條件進樣測定，以色譜峰面積(A)為縱坐標、質量濃度(C)為橫坐標進行線性回歸。結果見表1。

表1 線性關系考察結果

精密度試驗:精密量取同一對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，重復進樣5次。結果鹽酸小檗堿、丹皮酚、馬錢苷的 RSD均為0.10%(n=5)，表明儀器精密度良好。

重復性試驗:取同一批樣品6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定峰面積。結果鹽酸小檗堿、丹皮酚、馬錢苷的 RSD分別為 0.20%，0.20%，0.30%(n=6)，表明方法重復性較好。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，室溫下避光密封放置，分別于 0，2，4，8，12 h時進樣測定。結果鹽酸小檗堿、丹皮酚峰面積的RSD 分別為 0.51% ，0.93% ，0.57%(n=5)，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

加樣回收試驗:稱取已知3種成分含量的樣品1.000 g，共9份;精密量取對照品貯備液10 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取該對照品溶液3，5，10 mL各3份，加入9份樣品中，按擬訂方法制備供試品溶液，進樣測定，計算回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果(n=9)

2.4 樣品含量測定

3 討論

按擬訂色譜條件，對3批樣品制備的供試品溶液進行分析，將峰面積分別代入線性回歸方程，計算含量。結果見表3。

表3 樣品含量測定結果(mg/g，n=3)

取鹽酸小檗堿、丹皮酚對照品，分別用甲醇溶解，使用UV－240分光光度計，于200～400 nm波長處掃描，3個成分的最佳檢測波長分別為:鹽酸小檗堿266 nm和229 nm(A266nm＜A229nm)，丹皮酚275 nm和228 nm(A275nm＞A228nm)，馬錢苷236 nm。綜合考慮，選擇230 nm為測定波長。

稱取樣品適量，分別以甲醇－水(1∶1)、水、甲醇3種溶劑，采用回流及超聲2種方法，分別提取60，30，15 min。結果超聲處理不及回流效果好，前2種溶劑提取的樣品中，鹽酸小檗堿含量不及甲醇效果好，故采用甲醇提取。丹皮酚和鹽酸小檗堿在熱水中溶解，馬錢苷在水中極易溶解。經水處理后，溶液黏稠度較大，不易濾過，且雜質峰較多，影響分離效果，故放棄。丹皮酚在提取過程中，易隨蒸氣揮發，故在回流過程中應注意密閉性，以減少成分損失。丹皮酚(4.248/4.125 mg/g)、馬錢苷(1.498/2.047 mg/g)2 種成分的測定，與《中國藥典(一部)》標準中單成分的測定相比，均能達到質量控制的目的。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:821－822，640－641.