固相微萃取?氣相色譜／質譜技術在部分腸桿菌鑒定中的應用

黃冬薇 張德明 譚瑞星 郭振輝

固相微萃取?氣相色譜／質譜技術在部分腸桿菌鑒定中的應用

黃冬薇 張德明 譚瑞星 郭振輝

目的應用固相微萃取?氣相色譜／質譜聯用技術（SPME?GC／MS）檢測分析體外培養腸桿菌的揮發性有機物（VOCs），探討SPME?GC／MS檢測應用于腸桿菌菌種鑒別的可行性。方法取腸桿菌40株，培養24 h后，通過SPME?GC／MS技術收集并檢測分析細菌培養產生的VOCs。結果40株腸桿菌檢測出濃度較高的VOCs有14種，而乙酸在大腸埃希菌菌種的檢出率為100%，在其余菌種中檢出率為0，3?甲基?1?丁醇在肺炎克雷白菌種、十四烷醇酯在產氣腸桿菌中檢出率均為100%，在其余菌種中檢出率均為0。3?甲基?1?丁醇，乙酸、吲哚，十四烷醇酯分別為肺炎克雷白菌、大腸埃希菌、產氣腸桿菌的相對特異性VOCs。結論通過SPME?GC／MS技術可檢測到部分腸桿菌的特異性VOCs，將其應用于腸桿菌菌種的鑒別具有可行性。

揮發性有機物；下呼吸道感染；固相微萃取；氣相色譜／質譜

老年人是下呼吸道感染的主要群體，且感染患病率、病死率高，其原因與免疫和呼吸道防御功能減退、基礎疾病多、營養狀況差、容易誤吸等因素相關，目前老年人下呼吸道感染常見的病原菌主要為革蘭陰性桿菌，其中又以肺炎克雷白菌、大腸埃希菌等腸桿菌最為常見，而早期、準確的病原學診斷對下呼吸道感染的治療至關重要［1?2］，但目前起始抗生素治療往往缺乏可靠的病原學資料，通常為經驗性治療。因此，一種便捷、快速、無創的鑒別感染細菌菌種的方法對于抗生素準確、及時的應用有著重要的指導意義。近年來，有應用氣相色譜／質譜聯用技術（SPME?GC／MS）檢測患者呼出氣揮發性有機物（VOCs）以達到快速診斷結核菌感染的報道［3］，本研究則選取臨床下呼吸道感染常見的腸桿菌科細菌作為研究對象，通過SPME?GC／MS檢測分析體外培養腸桿菌VOCs，探討該技術應用于細菌鑒別的可行性，并為進一步探討SPME?GC／MS技術直接檢測下呼吸道感染患者呼出氣VOCs以鑒別感染病原菌的研究打下實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 取自我院檢驗科微生物室的腸桿菌科菌株40株，其中大腸埃希菌12株、肺炎克雷白菌12株、陰溝腸桿菌10株、產氣腸桿菌6株，細菌菌株的分離和鑒定均由我院檢驗科微生物室按《全國臨床檢驗操作規程（第2版）》進行，細菌鑒定采用法國Bio?Vitek自動化細菌鑒定儀進行鑒定。

1.2 儀器與試劑 血培養基；血液增菌培養液；0.45%鹽水（Biomerieux Inc）磁攪拌子；雙相血培養瓶（梅里埃公司）；恒溫恒濕箱、比濁測定儀（VITEK DENSICHEK）；SPME手柄；75μm CAR／PDMS SPME萃取頭；毛細管柱（INNOWAC 30 m×0.25 m×0.25 μm）；氣?質聯用儀（美國Voyager GC／MS）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細菌的增殖與培養：刮取所選細菌培養基上生長的菌落，于磨菌器內鹽水研磨呈均勻的菌液，再加鹽水稀釋，通過比濁測定儀測定后，分別制成1.0 McFar?land混懸液。在無菌操作下打開培養瓶蓋，將攪拌子放入其中，并在各培養瓶上分別標記各個細菌菌種和空白對照。將雙相血培養瓶蓋酒精消毒后，先將生理鹽水3 ml注入空白對照瓶中，再用注射器取各細菌菌液3 ml注入已標記的培養瓶內，隨后將培養瓶放入恒溫恒濕箱中，培養24 h。

1.3.2 細菌培養瓶上層氣體的采樣濃縮：細菌培養液用磁力攪拌子中速攪拌，將SPME針管穿過樣品瓶頂空瓶隔墊，伸入瓶中，將纖維頭置于培養液上部，并在室溫下頂空式萃取30 min。

1.3.3 細菌VOCs的分離與檢測：實驗采用GC／MS方法檢測分析VOCs，吸附樣品的SPME插入氣相色譜／質譜進樣口進行上樣，GC／MS條件為HP25MS石英毛細管柱；載氣為He，流速為1.0 ml／min，進樣口溫度250℃；程序升溫：起始50℃，保持2 min，再以8℃／min升溫至180℃，再以10℃／min升溫至240℃，保持5 min；接口溫度280℃；質譜掃描范圍35～550 u；電子能量：70 V。

1.4 數據處理 將各細菌組檢測得出的質譜圖與空白對照的質譜圖對比，篩選出有意義峰值，采用Wi?ley2713和Nist98譜庫進行譜圖檢索。

2 結果

40株發酵菌共檢測出濃度較高的VOCs有14種，檢出的VOCs多為醇類及酯類物質，其中肺炎克雷白菌、大腸埃希菌、產氣腸桿菌、陰溝腸桿菌共同檢出的成分有乙醇、1?葵醇、1?十二醇、順式?9?十六碳單烯酸、1?十六醇。乙酸在大腸埃希菌菌種的檢測率為100%，在其余菌種中檢出率為0。3?甲基?1?丁醇在肺炎克雷白菌種、十四烷醇酯在產氣腸桿菌中檢出率均為100%，而在其余菌種中檢出率為0，見表1。

表1 各細菌VOCs檢出率（n，%）

3 討論

GC／MS檢測有著高選擇性、高分離效能、高靈敏度、高速度等特點，在疾病的快速診斷方面有著很大的優勢。近年來將GC／MS應用于疾病診斷的研究層出不窮，呼吸系統疾病的生化診斷長期滯后于機體其他器官，對于許多無法耐受有創檢查的老年患者而言，無創、快捷的診斷方法的出現無疑可以提供極大的便利條件。目前通過GC／MS檢測VOCs在細菌中的應用主要見于工業及環境監測領域，如檢測食品及土壤中的細菌、真菌的VOCs［4?5］，亦有文獻報道將氣相色譜法應用于口腔、腹部厭氧菌感染的研究中［6］，2007年Phillips等［3］在肺結核患者的呼出氣中檢測到體外培養結核菌產生的特異性VOCs，應用該特異性氣體來診斷肺結核有很好的敏感性及特異性。但將該方法應用于其他下呼吸道感染細菌的研究國內外文獻少有報道。

近年來通過檢測人體呼出氣VOCs來反映機體的病理、生理狀態成為研究的熱點。研究范圍涵蓋了慢性炎癥性疾病、惡性腫瘤、腎功能不全、器官移植排斥等疾病［7?9］。本研究以臨床常見腸桿菌為研究對象，通過SPME?GC／MS可檢測到肺炎克雷白菌、大腸埃希菌、產氣腸桿菌、陰溝腸桿菌的多種VOCs，多以醇類為主，各菌間有多種共同產生的VOCs及相對特異性的VOCs，在同類菌屬中，各株檢出的VOCs也不盡相同，細菌代謝產物的重疊以及各菌的個體差異使得分辨出細菌的特異性VOCs較為困難。實驗中可檢測到肺炎克雷白菌、大腸埃希菌、產氣腸桿菌的相對特異性VOCs，但由于細菌樣本量較小，檢測細菌菌種不多，尚難確定這些VOCs是否為各細菌的標志性氣體，后期如進一步擴大樣本量并將檢測菌種增加至革蘭陽性菌、真菌等菌種，對于分析細菌的鑒別會更有意義。但SPME?GC／MS分析方法制定實驗操作的標準化流程較難，由于實驗條件的局限性，并未能在多種條件下比較檢測條件的優勢，因此仍有待進一步探索比較。

本實驗通過SPME?GC／MS技術可檢測出肺炎克雷白菌、大腸埃希菌、產氣腸桿菌的相對特異性VOCs，這些相對特異性VOCs有助于細菌的鑒別，為進一步探討SPME?GC／MS技術直接應用于檢測下呼吸道感染患者呼出氣VOCs的研究打下實驗基礎。但是，人呼出氣中成分較為復雜，細菌VOCs在人體呼出氣中含量極其微小，人體在感染狀態時因氧化應激產生VOCs對細菌代謝物檢測也有一定的干擾，因此VOCs檢測在下呼吸道感染中的應用仍需大量的后續研究。

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［2］ 卓超.多重耐藥時代經驗性治療的抗菌藥物定位［J］.中國臨床藥理學雜志，2013，29（4）：280?292.

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［4］ Mauriello G，Capece A，D'Auria M，et al.SPEME?GC method as a tool to differentiate VOC profiles in Saccharomy?ces cerevisiae wine yeasts［J］.Food Microbiol，2009，26（3）：246?252.

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Application of solid?phase m icro?extraction and gas chromatography?mass spectrometry technique in identifying enterobacteriaceae

HUANG Dong?wei，ZHANG De?ming，TAN Rui?xing，GUO Zhen?hui．
The Third Department of Ger?ontology，General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA，Guangdong Provincial Key Laboratory of Geriatric In?fection and Organ Function Support，Guangzhou 510010，China

ObjectiveTo detect the volative organic compounds（VOCs）of enterobacteriaceae cultured in vitro with solid?phase micro?extraction and gas chromatography?mass spectrometry（SPME?GC／MS）technique.MethodsForty samples of enterobacteriaceae were collected and cultured in the mycobottles for 24 hours，and the VOCs of the bacte?ria were detected and analyzed by SPME?GC／MS.ResultsFourteen main VOCs were detected from all bacteria，and the detection rate of acetic acid was 100%in escherichia coli group and 0 in other enterobacteriaceae groups.The detection rate of 1?butanol 3?methyl was 100%in klebsiella pneumoniae group and the detection rate of 1，14?Tetradecanediol was 100% in enterobacter aerogenes group，but the detection rate was 0 in other enterobacteriaceae groups.1?Butanol，3?methyl might be the specific VOCs for klebsiella pneumoniae，Acetic acid and Indole might be the specific VOCs for escherichia coli，and 1，14?Tetradecanediol for enterobacter aerogenes.ConclusionsThe specific VOCs of enterobacteria can be detected with SPME?GC／MS technique.The application of SPME?GC／MS technique in identifying enterobacteriaceae is feasible.

volative organic compounds；lower respiratory infections；solid?phase micro?extraction；gas chroma?tography?mass spectrometry

R 446.5

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2015.01.014

2014?04?13）

廣州市科技計劃項目（2009Z1?E421）

510010廣東省廣州市，中國人民解放軍廣州軍區廣州總醫院干部病房三科廣東省老年感染與器官功能支持重點實驗室