胰島素抵抗對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)功能及順鉑敏感性的影響

曹 卉 劉 穎

胰島素抵抗對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)功能及順鉑敏感性的影響

曹 卉 劉 穎

目的探討胰島素抵抗對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)功能及順鉑敏感性的影響。方法選取卵巢癌患者200例，根據(jù)是否患有2型糖尿病分為兩組，胰島素抵抗組83例、非胰島素抵抗組127例。穿刺獲取腫瘤組織和正常組織作為實驗對象，采用免疫組化法測定IGF-1蛋白表達(dá)量，流式細(xì)胞術(shù)法測定IGF-1R蛋白表達(dá)量，MTT法測定不同濃度順鉑作用于腫瘤細(xì)胞的IC50(半數(shù)抑制濃度)值。結(jié)果①胰島素抵抗組IGF-1蛋白表達(dá)的HIS值為10.1±1.68，與非胰島素抵抗組(6.5±2.14)比較，明顯較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；②胰島素抵抗組IGF-1R蛋白表達(dá)量為(281.1±1.78)，與非胰島素抵抗組(264.6±5.32)比較，明顯較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；③胰島素抵抗組不同濃度順鉑作用于腫瘤細(xì)胞的IC50值為(14.93±0.15)，與非胰島素抵抗組(2.41±0.08)比較，明顯較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論胰島素抵抗能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖，降低卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性，對臨床用藥具有指導(dǎo)意義，值得臨床推廣。

卵巢癌；胰島素抵抗；細(xì)胞生物學(xué)；順鉑敏感性

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:1606～1608)

卵巢癌(oophoroma)是由于卵巢上皮細(xì)胞或生殖細(xì)胞惡性增生而引起的1種惡性腫瘤性疾病，發(fā)病率僅次于子宮頸和子宮體癌，是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤[1-2]。本病多發(fā)于35歲以上的中青年女性，據(jù)調(diào)查統(tǒng)計[3]，我國卵巢癌患者的發(fā)病率為6.31/10萬，并且以每年1.83%的速度逐年上升。卵巢癌早期癥狀不明顯，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)多已診斷為晚期[4]，無法采用手術(shù)治療，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采取以鉑類藥物等為主的化療療法，由于獲得性耐藥等原因，效果并不理想。研究發(fā)現(xiàn)[5]，糖尿病患者體內(nèi)存在胰島素抵抗，患子宮內(nèi)膜癌、大腸癌、乳腺癌等腫瘤的幾率明顯高于正常人，二甲雙胍等胰島素增敏劑可以明顯抑制腫瘤生長[6]。但目前關(guān)于胰島素抵抗對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)功能及耐藥性影響的研究較少，為了增強(qiáng)療效，改善其預(yù)后，為卵巢癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月至2014年1月于我院以卵巢上皮細(xì)胞癌為診斷而收入院患者200例，根據(jù)是否患有2型糖尿病分為胰島素抵抗組和非胰島素抵抗組。胰島素抵抗組83例，平均年齡(42.3±5.7)歲；非胰島素抵抗組127例，平均年齡(43.6±6.1)歲。患者病程<1年。兩組患者的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。患者自愿參與本實驗，并簽署知情同意書。方案獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)并全過程跟蹤。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

經(jīng)病理學(xué)檢查確診為卵巢上皮細(xì)胞癌；病理學(xué)分期為Ⅰ～Ⅱ期[7]；年齡為35～50歲；患有糖尿病的患者確診為2型糖尿病，病程>3年；患者均為首次治療。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

經(jīng)過手術(shù)、放療、化療等治療的患者；心、腦、肝、膽嚴(yán)重疾病；其他惡性腫瘤；神志異常以及近2個月來服用二甲雙胍等胰島素增敏劑；由于各種原因不能完成實驗的患者。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

穿刺獲取所有患者的腫瘤組織作為實驗組，正常組織作為正常對照組，制成細(xì)胞懸浮液，常規(guī)培養(yǎng)。

1.4.1 IGF-1蛋白表達(dá)的測定 采用免疫組化法測定[8]。取生長良好的對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后放入培養(yǎng)基中，接種在6孔板上，密度為4×105個/cm2，48 h后經(jīng)4%甲醛固定、3%雙氧水氧化，按說明書分別加入IGF-1一抗、二抗工作液，孵育，PBS清洗后，采用DAB顯色，經(jīng)蘇木精復(fù)染后沖洗，封片。

由兩名高年資的病理醫(yī)師在高倍鏡下對切片進(jìn)行觀察，隨機(jī)選取3個高倍視野，統(tǒng)計陽性細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度并評分，經(jīng)核對得出結(jié)果。陽性細(xì)胞計數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞是指細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒的細(xì)胞，無陽性細(xì)胞數(shù)為0分，1%～10%為1分,11%～50%為2分，51%～80%為3分，81%～100%為4分；染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：0分為無染色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。總評分(HIS值)=陽性細(xì)胞計數(shù)評分×染色強(qiáng)度評分。

1.4.2 IGF-1R蛋白表達(dá)的測定 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)法測定[9]。取生長良好的對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化、PBS沖洗后，用離心機(jī)離心5 min，棄上清，加入PBS液，使其密度為每100 μl 11×106，將IGF-1R用FITC標(biāo)記后加入細(xì)胞液中，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測IGF-1R蛋白表達(dá)含量。

1.4.3 不同濃度順鉑對腫瘤細(xì)胞的抑制作用 取生長良好的對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化，稀釋成每ml含5×103細(xì)胞的細(xì)胞液，接種在96孔板，培養(yǎng)1 d，分別加入0.25 μg/ml、2.5 μg/ml、25 μg/ml的順鉑，培養(yǎng)48 h，加入20 μl噻唑藍(lán)(5 mg/ml)，4 h后棄去上清，加入150 μl的0.2%二甲基亞砜，振蕩后應(yīng)用酶標(biāo)儀[10]測定孔A490 nm值并計算存活率和IC50(半數(shù)抑制濃度)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用卡方檢驗處理，以P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 IGF-1蛋白表達(dá)比較

采用免疫組化法測得胰島素抵抗組IGF-1蛋白表達(dá)的HIS值為(10.1±1.68)，與非胰島素抵抗組(6.5±2.14)比較，明顯較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 IGF-1R蛋白表達(dá)

通過流式細(xì)胞法測得胰島素抵抗組IGF-1R蛋白表達(dá)量為(281.1±1.78)，與非胰島素抵抗組(264.6±5.32)比較，明顯較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

A為胰島素抵抗組，B為非胰島素抵抗組。

2.3 不同濃度順鉑作用于腫瘤細(xì)胞的IC50值比較

通過MTT法測得胰島素抵抗組不同濃度順鉑作用于腫瘤細(xì)胞的IC50值為(14.93±0.15)μg/ml，與非胰島素抵抗組(2.41±0.08)μg/ml比較，明顯較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

卵巢癌與宮頸癌、子宮體癌稱為女性生殖系統(tǒng)的三大殺手，嚴(yán)重危害女性的生命健康。研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病可能與內(nèi)分泌功能、精神因素、免疫、遺傳、不良生活習(xí)慣、營養(yǎng)不調(diào)、以及外界的化學(xué)、生物等致癌因素有關(guān)，具有較高的發(fā)病率和死亡率[11]。由于診斷手段有限加之臨床癥狀不典型，發(fā)現(xiàn)時多為晚期，化療效果不如人意，尤其是2型糖尿病患者，由于對目前常用的順鉑具有耐藥性[12]，效果更不理想。有資料顯示[13]，2型糖尿病患者體內(nèi)存在胰島素抵抗，能夠代償性的促進(jìn)IGF-1含量增加，與IGF-1R受體結(jié)合，發(fā)揮與胰島素相似的功能。IGF-1屬于1種生長因子，具有促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的作用，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，但需要與IGF-1R受體結(jié)合才能發(fā)揮作用，很多研究發(fā)現(xiàn)[14]，IGF-1及IGF-1R在多數(shù)惡性腫瘤組織中表達(dá)量明顯增多。另外，資料顯示[15]，IGF-1R在介導(dǎo)信號傳導(dǎo)的過程中，可以影響PI3K/AKT通路，阻礙AMP蛋白酶 (AMPK)的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，這可能與腫瘤細(xì)胞對順鉑的耐藥性增強(qiáng)有關(guān)。目前關(guān)于卵巢中IGF-1及IGF-1R表達(dá)情況研究較少，筆者做了相關(guān)研究，以探究胰島素抵抗對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)功能及耐藥性影響。

研究結(jié)果顯示，胰島素抵抗組IGF-1蛋白表達(dá)的HIS值為10.1±1.68，與非胰島素抵抗組(6.5±2.14)比較，明顯較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示胰島素抵抗可以使卵巢癌組織中IGF-1含量升高；胰島素抵抗組IGF-1R蛋白表達(dá)量為281.1±1.78，與非胰島素抵抗組(264.6±5.32)比較，明顯較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示胰島素抵抗可以促進(jìn)IGF-1R表達(dá)，使IGF-1充分發(fā)揮作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖；胰島素抵抗組不同濃度順鉑作用于腫瘤細(xì)胞的IC50值為(14.93±0.15)，與非胰島素抵抗組(2.41±0.08)比較，明顯較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示胰島素抵抗可以增加卵巢癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性，影響化療效果。

總之，胰島素抵抗能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖，降低卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性，對臨床用藥具有指導(dǎo)意義，值得臨床推廣。

[1] 李 巍,崔 恒,馮 捷,等.卵巢癌診斷的研究進(jìn)展〔J〕.中華婦產(chǎn)科雜志,2005,40(7):496-498.

[2] 林仲秋,李 晶.NCCN《 2012 卵巢癌包括輸卵管癌和原發(fā)腹膜癌臨床實踐指南》 解讀〔J〕.中國實用婦科與產(chǎn)科雜志,2012,28(3):163-165.

[3] 楊念念,嚴(yán)亞瓊,龔 潔.中國 2003-2007 年卵巢癌發(fā)病與死亡分析〔J〕.中國腫瘤,2012,21(6):401-405.

[4] 陳玉梅,王 麗,鐘麗紅,等.腫瘤標(biāo)志物在卵巢癌早期診斷中的應(yīng)用進(jìn)展〔J〕.當(dāng)代醫(yī)學(xué),2012,18(20):12-13.

[5] 李 芳,方 瑩.2 型糖尿病與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系分析〔J〕.長治醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2015,29(1):35-38

[6] 彭 錚,史惠蓉,謝 婭,等.二甲雙胍通過核因子-κB 信號通路抑制 p-糖蛋白逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞耐藥性的研究〔J〕.中國婦幼保健,2015,30(8):40-41.

[7] 盧 艷,姚德生,徐杰華.腹腔鏡在早期卵巢癌全面分期手術(shù)中安全性和有效性的 Meta 分析〔J〕.中國腫瘤臨床,2013,40(19):1174-1178.

[8] 蒲才秀,常淑芳,孫江川,等.2 種人卵巢癌裸鼠移植瘤模型的生物學(xué)特性比較研究〔J〕.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2012,36(11):1343-1346.

[9] 程芙蓉,胡 旻,王 青,等.可溶性血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白 C 受體對上皮性卵巢癌患者自然殺傷細(xì)胞和 Th17 細(xì)胞的影響〔J〕.中華內(nèi)分泌外科雜志,2015,9(1):60-62.

[10] 吳祖波,彭 華,白 燕,等.GYY4137 通過 Bcl-2/Bax/Cleaved caspase-3 信號通路改善柯薩奇病毒 B3 引起的大鼠乳鼠心肌細(xì)胞凋亡〔J〕.華中科技大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2014,43(4):371-375.

[11] 楊念念,嚴(yán)亞瓊,鄭榮壽,等.中國 2009 年卵巢癌發(fā)病與死亡分析〔J〕.中國腫瘤,2013,22 (8):617-621.

[12] 朱飲源,姚 軍,李 曼.糖原合成酶激酶3β對卵巢癌順鉑耐藥性的影響及其機(jī)制研究〔J〕.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2015,35(3):332-336.

[13] 柳 嵐,葉藝藝,閆曉潔,等.2型糖尿病患者血清 IGF-l,IGFBP-3 及胰島素水平的變化與結(jié)直腸癌關(guān)系的研究〔J〕.熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2013,13(8):957-960.

[14] 賀樂奇,申春梅,王龍武.上皮性卵巢癌組織中胰島素樣生長因子 1 及其相關(guān)蛋白的表達(dá)分析〔J〕.中國臨床醫(yī)學(xué),2014,21(2):118-121.

[15] 申洪昌.調(diào)控腫瘤細(xì)胞 IGF-1R 信號通路的關(guān)鍵分子研究〔D〕.山東大學(xué),2012.

(編輯：吳小紅)

Effect of Insulin Resistance on the Biological Function of Ovarian Cancer Cell and Sensitivity to Cisplatin

CAOHui,LIUYing.

Objective To study the effect of insulin resistance on the biological function of ovarian cancer cell and sensitivity to cisplatin.Methods 200 patients with ovarian cancer were selected,according to whether the patients had type 2 diabetes,were divided into 2 groups,the insulin resistant group 83 cases,and insulin non-resistant group 127 cases.Puncture for tumor and normal tissues was the experimental object,using immunohistochemical determination of IGF-1 protein expression,and IGF-1R protein expression was determined by flow cytometry method，MTT method for the determination of different concentrations of cisplatin on tumor cell IC50(half inhibitory concentration) values.Results ①The IGF-1 protein expression value of HIS of the insulin resistant group was 10.1±1.68,which was significantly higher compared to insulin non-resistant group (6.5±2.14)， the difference was statistically significant (P<0.05);②The expression of IGF-1R protein in insulin resistant group was 281.1±1.78,which was significantly higher compared to insulin non-resistant group (264.6±5.32),the difference was statistically significant (P<0.05);③The insulin resistant groups of different concentration of cisplatin to tumor cells IC50values was 14.93±0.15,which were significantly higher compared to insulin non-resistant group (2.41±0.08),the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion Insulin resistance can promote the proliferation of ovarian cancer cells,decrease the sensitivity of ovarian cancer cells to cisplatin,has guiding significance for clinical medication,and it is worthy of clinical promotion.

Ovarian cancer;Insulin resistance;Cell biology;Sensitivity to cisplatin

221004 中國人民解放軍第97醫(yī)院

劉 穎

10.3969/j.issn.1001-5930.2015.11.007

R737.31

A

1001-5930(2015)11-1606-03

2015-01-09

2015-05-21)

The97thHospitalofPLA,Xuzhou,221004