醫藥潔凈廠房消毒滅菌方式的探討及相關驗證

陳 琦

醫藥潔凈廠房消毒滅菌方式的探討及相關驗證

陳 琦

（南京白敬宇制藥有限責任公司，江蘇南京210038）

著重介紹了紫外線消毒滅菌、甲醛熏蒸滅菌和臭氧消毒滅菌的特點，并對相應的滅菌效果進行了驗證，以保證醫藥潔凈廠房的滅菌效果。

凈化空調；潔凈廠房；滅菌設計；消毒；滅菌

0 引言

隨著《藥品生產質量管理規范（2010年修訂）》[1]的實施，我國對藥品生產的管理變得更加嚴格，其目的是為了防止生產中污染、混淆、交叉污染和人為差錯的產生，其中凈化空調是整個制藥系統中的重要組成部分。潔凈室為了達到相應的室內環境，除了控制潔凈室內空氣的含塵濃度外，對細菌和微生物的存在數量也要進行控制。進入潔凈室內的空氣，雖然經過初效、中效、高效過濾器三級過濾，把大多數的塵埃粒子及附著其上的細菌和微生物阻滯在潔凈室外，但是它們仍然存在于空調系統的設備、管道、風口及過濾器上，一旦有適宜的環境，它們就會繁衍生殖，還有少量的細菌和微生物穿透各級過濾器進入潔凈室內，成為潔凈室內微生物。如果不對潔凈室進行消毒滅菌，它們將不斷繁殖，破壞室內空氣環境品質，影響產品質量，因此，應定期對潔凈室進行滅菌消毒。

醫藥工業的潔凈室消毒（滅菌）方式主要有：紫外線消毒法、消毒液（甲醛熏蒸）滅菌法和臭氧消毒（滅菌）法。

1 紫外線消毒

紫外線的殺菌能力隨環境溫度、濕度、風速等因素變化；環境溫度20℃、相對濕度40%～60%時，滅菌效果較好；環境溫度0℃、輻射能力低于60%、相對濕度＞60%，則輻射能力降低。紫外線消毒的殺菌能力隨使用時間的增加而降低；紫外燈的輻射強度隨照射距離的增加而減弱；紫外燈的平均使用壽命為2 000 h左右。

紫外線可以殺滅多種微生物，包括細菌繁殖體、芽胞、病毒、真菌、支原體等，消毒使用的紫外線是200～275 nm的C波紫外線，殺菌作用最強的波段是250～270 nm。紫外線的殺菌效果與紫外線輻射強度有直接關系，消毒使用的紫外線滅菌燈光源產生的輻射值必須能夠達到國家標準（電壓220 V、環境相對濕度60%、溫度20℃時，紫外線強度不得低于70μW/cm2）。為了獲得滿意的紫外線輻射強度，就需要對紫外燈的玻璃管、反射罩和使用壽命提出相應要求。

WHO和歐共體GMP規定：由于紫外線滅菌效果有限，不得用于替代化學消毒；最終滅菌不能使用紫外照射法。

1.1 紫外線消毒的常用形式

在潔凈室頂棚上均布置紫外線殺菌燈，利用其產生的紫外線輻射進行物體表面和空氣的消毒滅菌。

1.2 紫外線消毒的優點

紫外線滅菌的優點有：操作簡單，管理方便，機動靈活，可以根據生產需要隨時進行個別房間的消毒滅菌。

1.3 紫外線消毒的缺點

紫外線消毒的缺點有：

（1）紫外線燈射出的紫外線強度，隨著使用時間的增加而減弱，因而消毒能力不斷減弱。

（2）紫外線穿透力弱，容易被生產設備阻擋，出現死角，影響殺菌效果。

（3）紫外線殺菌受相對濕度的影響較大，當潔凈室內相對濕度＞60%時，其滅菌效果明顯減弱，相對濕度＞80%時，不宜使用。

（4）紫外線輻射能量低，僅能殺滅直接照射到的微生物，因此，必須使消毒部位充分暴露于紫外線下。

1.4 紫外線消毒的操作

1.4.1 紫外燈的使用時間

每天上班前30m in或中午停產時為紫外燈照射時間。以波長2 540 A左右的紫外線殺菌力最強，一般于空間每6～15m2安裝1只紫外線燈，燈管距地面2.5～3m為宜，紫外線燈于室內溫度10～15℃、相對溫度40%～60%的環境中使用殺菌效果最佳。

每周一紫外燈照射時間應延長至40m in。

操作人員進入潔凈區時應提前10m in關掉紫外燈。

1.4.2 紫外燈管的清潔

應用毛巾蘸取無水乙醇擦拭其燈管，且不得用手直接接觸燈管表面。

1.5 紫外燈對潔凈區消毒效果的驗證

紫外燈對潔凈區消毒效果的驗證主要由紫外線的波長、紫外線的強度、照射時間的確認和消毒后效果及有效期的確認等組成，以證明所用的紫外燈對潔凈區的消毒是可行的。

1.5.1 紫外燈、紫外燈波長的確認

對紫外燈、紫外燈波長進行核對或測試。

1.5.2 紫外線強度的確認

對潔凈區的紫外燈的強度進行測試，檢測點均勻分布在潔凈區房間內。

1.5.3 紫外燈對潔凈區消毒效果的挑戰性試驗及照射時間的驗證

紫外燈對潔凈區消毒效果的挑戰性試驗方法：用純化水對潔凈區進行清潔后，將裝有枯草芽孢桿菌的生物指示劑（使用前測定其初期數，應不少于10個）表皿置于被測潔凈區的各監測點，打開表皿，然后分別開啟紫外燈0.5 h、1 h、1.5 h、2 h，消毒結束后，開啟空調凈化系統，并將枯草芽孢桿菌生物指示劑放入大豆酪素消化液體培養基中，在37℃下培養3天，觀察枯草芽孢桿菌是否被殺滅，若沒有枯草芽孢桿菌生長，則為合格。

1.5.4 紫外燈對潔凈區消毒效果的表面污染試驗

紫外燈對潔凈區消毒效果的表面污染試驗方法：用純化水對潔凈區進行清潔后，開啟紫外燈，消毒結束后，開啟空調凈化系統，潔凈區內的墻壁、地面、工作臺等表面用事先經過滅菌的生理鹽水、注射用水或緩沖液（磷酸緩沖生理鹽水）浸潤的適當大小的滅菌紗布或滅菌脫脂棉充分擦拭約10 cm2的面積，然后放入經滅菌處理的廣口瓶中，加入一定量的注射用水振搖，對其進行浸取，將浸取液倒入裝有牛肉湯培養液的培養皿中，進行細菌培養，至少培養3天，若無細菌生長，則為合格。

1.5.5 紫外燈對潔凈區消毒效果的有效期驗證

紫外燈對潔凈區消毒效果的有效期驗證方法：用純化水或注射用水對潔凈區進行清潔后，開啟紫外燈，消毒結束后，開啟空調凈化系統，分別在6 h、12 h、24 h、32 h、40 h、48 h，對潔凈區內的同一地面用事先經過滅菌的生理鹽水、注射用水或緩沖液（磷酸緩沖生理鹽水）浸潤的適當大小的滅菌紗布或滅菌脫脂棉充分擦拭約10 cm2的面積，然后放入經滅菌處理的廣口瓶中，加入一定量的注射用水振搖，對其進行浸取，將浸取液倒入裝有牛肉湯培養液的培養皿中，進行細菌培養，至少培養3天，以培養出細菌的取樣點確定紫外燈對潔凈區消毒效果的有效期。

2 甲醛熏蒸滅菌

對潔凈室氣體消毒的傳統辦法是將消毒液通過蒸發來熏蒸，通常的消毒液有環氧乙烷、過氧乙酸、甲醛溶液等，濕度在65%左右、溫度在24～40℃的甲醛消毒效果是最好的，其消毒原理主要是由于甲醛能破壞微生物的活性成分從而達到消毒的作用。通常我們將甲醛溶液倒入高錳酸鉀中來對潔凈室的空氣進行消毒，這主要是因為高錳酸鉀遇到甲醛后釋放大量的熱，使甲醛蒸發彌漫到空氣當中。甲醛蒸汽具有強烈的刺激性氣味，屬于高毒物具有致癌性。2.1甲醛熏蒸滅菌的特點

（1）消毒滅菌作用時間長，影響生產。消毒時間12 h，靜置4 h，排風8 h，消毒1次最少需要24 h。消毒1次要停產2～5天。

（2）為了排除刺激性氣味，消毒滅菌后長時間開啟通風系統，非生產運行時間過長，能源浪費大。

（3）需要設置排風系統或設施。

（4）易產生二次污染。如甲醛熏蒸會出現多聚甲醛聚合物（白色粉末），附著在潔凈室內的維護結構和設備管道表面上，在消毒后幾天內，其懸浮離子數會增加，甲醛聚合物也逐漸解聚成甲醛，對生產操作人員的危害很大。

（5）消毒間隔時間長。由于每次化學試劑熏蒸消毒滅菌時間最少需24 h，不能天天進行，因此目前各生產廠家大多采用每月1次大消毒，而微生物污染源——人、物、料、室外新鮮空氣等卻天天要進出潔凈室，其帶入的微生物不能得到及時殺滅，會出現微生物隨時間延長而增加的現象。

（6）甲醛有強烈的刺激性氣味，消毒滅菌后去除殘留氣味時間長，對生產操作人員身體有害，有致癌作用。

2.2 甲醛熏蒸消毒滅菌的操作

（1）用純化水擦洗建筑物與設備表面，然后用5%的麝香草酚溶液擦洗或噴灑，最后再用純化水擦拭建筑物與設備表面。

（2）計算消毒滅菌空間體積，包括房間體積與風管體積，按10 m L/m3準備36%的甲醛溶液，按2～3 mg/m3準備高錳酸鉀溶液。

（3）在各個房間內布置實驗裝置，如培養皿、支架、2張枯草桿菌試紙（一張作對照，另一張作無菌實驗）。

（4）消毒滅菌前準備：關閉空調機，在設定的地點放置裝有定量高錳酸鉀的容器，雙層紗布蓋住容器口，旁邊配有定量36%甲醛溶液，設定地點的數目應與房間面積有關。

（5）消毒滅菌：將甲醛溶液倒入裝有高錳酸鉀的容器中，迅速離開房間，讓甲醛氣體擴散30m in，開啟空調機20m in，關閉空調機，熏蒸開始，不低于7 h后打開空調機進行排氣。

（6）熏蒸后空氣總甲醛殘留量的測試：在排氣后，首先確定空氣中的甲醛含量，為了保證人能在潔凈室內安全健康地工作，必須要對甲醛的殘留量進行測試。甲醛殘留濃度標準：＜0.1mg/m3。

（7）用75%酒精擦拭建筑物與設備的表面，因為甲醛易溶于酒精，所以用酒精擦拭更易于清潔殘留的甲醛。

2.3 甲醛熏蒸消毒滅菌效果驗證

潔凈區經過甲醛熏蒸消毒滅菌后，室內的微生物檢測項目應該達到不同潔凈級別潔凈區的要求。根據風險評估判定最終風險點，以遠離進風口潔凈間墻壁、天花板、地板、工作臺表面為主要風險點，故可以在確定生物挑戰性試驗生物指示劑位置及表面微生物擦拭采樣點后，進行消毒滅菌效果驗證。

2.3.1 生物指示劑挑戰性試驗

2.3.1.1 生物指示劑的準備

消毒滅菌前將枯草芽孢生物指示劑（枯草黑色變種芽孢ATCC9372菌片）編號，拿進被消毒的房間，將置菌片的塑料管蓋打開，一起放到各房間的取樣點位置，記錄相應的編號和位置；消毒滅菌完畢將塑料管蓋蓋好、收回。然后以無菌操作將其置于培養液中，35～37℃下培養48 h，觀察細菌是否被殺死；同時，也可以無菌操作將2個未用甲醛消毒的菌片，直接放入培養液中培養，作陽性對照。

2.3.1.2 測試方法及步驟

（1）關閉潔凈室與外界聯系的全部門和傳遞窗，并確認潔凈室人員全部撤離。

（2）熏蒸消毒滅菌前檢查潔凈室關鍵房間的溫濕度（相對濕度在＞65%、溫度在24～40℃），達到甲醛熏蒸消毒的最佳條件。

（3）潔凈室操作人員到潔凈區的關鍵房間，向電飯鍋中加入甲醛，開啟電飯鍋，甲醛蒸發完全自動關閉電飯鍋電源。甲醛的使用量應參照潔凈區待消毒區域的空間容積，可按10m L/m3稱量36%甲醛溶液。

（4）啟動空調機20 m in，讓甲醛氣體均勻分布各個房間。

（5）關閉空調機，對房間進行熏蒸消毒。熏蒸試驗時間為12 h。

（6）啟動空調機，打開送排風系統排風12 h。

（7）消毒時間為12 h，檢驗人員戴上防毒面具進入潔凈區，按無菌操作將菌片放入培養液中（培養液浸透菌片），然后置于37℃下48 h培養，分別另取一支未經消毒的指示劑作陽性對照。

2.3.1.3 可接收標準

經48 h培養后，若培養液變渾濁，顏色由紅變黃判為陽性，若培養液澄清，顏色不變為陰性，繼續培養至7天，若仍無菌生長，則判為滅菌合格。

2.3.2 環境中甲醛殘留量檢測

（1）甲醛消毒滅菌結束后，在達到設定的時間后（2 h、4 h、6 h），選取關鍵房間用甲醛檢測儀分別測試待測潔凈間的甲醛殘留量，并作相應的記錄。

（2）可接受標準：甲醛殘留濃度＜0.1mg/m3。

2.3.3 表面微生物檢測

在潔凈區相應的天花板、地板、設備臺面、墻壁等處用接觸碟（內徑57mm）采樣。取樣時，打開碟蓋，均勻按壓接觸碟底板，確保全部瓊脂表面與取樣點表面均勻充分接觸，再蓋上碟蓋，并做標號，置30～35℃恒溫培養箱中培養72 h，計數。

用消毒液擦拭干凈被采樣處，使其免受污染。

表面微生物檢測可接受標準如表1所示。

表1 表面微生物檢測可接受標準

3 臭氧消毒（滅菌）

臭氧（O3）是有毒、淡藍色、不穩定的極強氧化劑，相對氣體密度為1.657（空氣=1.0）。臭氧是一種廣譜高效滅菌劑，具有強烈的殺菌消毒作用。臭氧在常溫下不穩定，極易分解成氧分子與氧原子，氧原子具有氧化性，能破壞微生物的細胞膜從而將其殺死，其多余的氧原子會自動結合成氧分子從而不會產生有毒的殘留物。臭氧產生的原料是氧氣與電能，通常由臭氧發生器產生臭氧。

3.1 臭氧濃度

用于殺滅空氣中的浮游菌時，臭氧濃度為2～4 ppm；用于潔凈室和設備表面滅菌時，臭氧濃度為10～15 ppm。

3.2 臭氧滅菌時間

在日常消毒操作中，如果只需對空氣滅菌，則只需要將臭氧發生器開啟1～1.5 h，如果需要對設備表面進行消毒，則需要將臭氧發生器開啟時間調到2～2.5 h。

3.3 臭氧發生器的選擇

3.3.1 臭氧消毒的濃度（C）

按臭氧消毒的效率和衛生部頒布的《消毒技術規范（2002年版）》[2]的標準，對空氣中的浮游菌，臭氧滅菌的濃度為2～4 ppm；對物體表面的沉降菌，臭氧滅菌的濃度為10～15 ppm。

3.3.2 臭氧的自然半衰期（S）

臭氧的半衰期在參比狀態下為20m in左右；1 h衰退率約為62.25%；設計、運用臭氧消毒40m in達到相對濃度后，繼續維持一段時間（1～1.5 h），即可達到對機器、設備和建筑物表面沉降菌的殺滅目的。3.3.3消毒空間體積（V）

設潔凈區體積為V1，HVAC系統風管容積為V2，為保持潔凈區正壓所補充的新風的臭氧消耗量為V3。

V3的確定根據消毒實踐，歸納出較可靠的經驗公式：V3=HVAC系統循環總風量（m3/h）×25%（假定新風補充量）×10%（保持潔凈區正壓所補充的新風量）×33.75%（計算應用臭氧半衰率的預算值），即V3≈循環系統總風量×0.944%，則消毒空間體積為：V=V1+V2+V3。

3.3.4 臭氧發生器的臭氧發生量

空氣中的臭氧濃度（C）應達到10 ppm，折算為19.63mg/m3；臭氧發生器工作1 h后，臭氧自然衰退率（S）為62.25%；則選擇臭氧發生器的臭氧發生量W（mg/h）=

3.4 臭氧消毒滅菌的操作

3.4.1 消毒前準備

打開空調機，將新風閥門關小到能保持房間的正壓，將排風機打開，將回風閥門打開，使通風系統形成一個自循環系統，能提高臭氧消毒的效率。

3.4.2 消毒操作

按照計算好的臭氧發生量將臭氧發生器設置在相應的檔位上，打開臭氧發生器，臭氧消毒開始。

3.4.3 消毒結束

在臭氧消毒經過規定的時間后，將臭氧發生器關閉，將新風閥門恢復到原來的狀態，臭氧消毒（滅菌）結束。

3.5 臭氧消毒（滅菌）效果驗證

3.5.1 臭氧濃度測試

3.5.1.1 合格標準

臭氧濃度：在臭氧發生器開啟后40min內潔凈室內臭氧濃度≥10 ppm（19.63mg/m3），且所有潔凈區域中臭氧濃度均≥10 ppm（19.63mg/m3）。

消毒時間：所有潔凈區域內臭氧濃度達到10 ppm時開始計時，直到臭氧發生器停止工作臭氧濃度降至10 ppm時終止，時間≥60m in。

臭氧消毒（滅菌）后，臭氧濃度衰減至安全標準0.15 ppm所需的時間應≤30m in。

3.5.1.2 試驗條件

環境條件：環境溫度16～28℃；相對濕度45%～65%；室內無外界強氣流，無強烈陽光照射或其他熱輻射。

消毒時關閉新風口和回風排放閥門，使整個被消毒的潔凈區空氣通過凈化系統風管形成循環，臭氧發生器開始工作。

3.5.1.3 測試地點

選取距離空調箱送風口最遠且送風口分布最稀少的房間進行測試。

3.5.1.4 測試方案

臭氧發生器開啟時開始測試，每10m in用帶打印功能的臭氧檢測儀測試1次；發生器開啟40m in后，此時臭氧濃度呈緩慢上升；連續監測2 h；臭氧發生器關閉，空調送風開始時測試1次，每10m in測試1次，連續監測1 h。

3.5.2 臭氧滅菌性能確認

確認預定的臭氧消毒程序在潔凈區空間消毒后微生物達到要求。

3.5.2.1 金黃色葡萄球菌挑戰性試驗

確認預定的臭氧消毒程序在潔凈區空間消毒后，微生物殺滅率≥90%。

（1）生物指示劑的制備：取金黃色葡萄球菌制備菌液培養48 h后，稀釋成1 200個/m L。臨用前在營養瓊脂培養基平皿中加入1m L上述菌液，并使其在培養基表面均勻分布。

（2）選取關鍵房間進行測試，每個房間放置2碟。

（3）臭氧發生器開啟的同時打開注有菌液的培養皿上蓋，至臭氧消毒程序結束。

（4）把培養皿放入37℃恒溫箱中培養48 h，進行菌落計算。同時以未經臭氧處理的培養皿作空白對照。

（5）計算殺滅率：

3.5.2.2 浮游菌的檢測

開啟浮游空氣塵菌采樣器，采樣量為1m3。用氣點采完樣后將培養皿置于30～35℃中培養3天，觀察微生物生長情況。

浮游菌檢測可接受標準如表2所示。

表2 浮游菌檢測可接受標準

3.5.2.3 沉降菌檢查

參照GB/T16294—2010《醫藥工業潔凈室沉降菌的測試方法》[3]，將制備好的肉湯瓊脂培養基按采樣點布點位置離地0.8～1.5m處放置，打開培養皿蓋（直徑90mm），暴露30m in，在30～35℃中培養48 h進行菌落計數。

沉降菌檢測可接受標準如表3所示。

表3 沉降菌檢測可接受標準

4 結語

經過上述介紹，我們可以了解到制藥企業目前主要應用的潔凈廠房消毒滅菌方法。對潔凈區的消毒滅菌方法應不少于一種，合理利用不同的消毒滅菌方式，直接影響著產品質量和人員的生命安全。同時，消毒滅菌方法的驗證是極其重要的，只有通過驗證，才能肯定消毒滅菌方式的有效性和安全性。

［1］藥品生產質量管理規范（2010年修訂）［S］

［2］消毒技術規范（2002年版）［S］

［3］G B/T16294—2010醫藥工業潔凈室（區）沉降菌的測試方法［S］

2014-10-18

陳琦（1980—），男，江蘇南京人，工程師，從事設備管理工作。