某市蒙古族與漢族肺腺癌EGFR基因突變的分析

孟令茹 袁曉榮 曹 坤 楊雪潔 金 娜

（內蒙古包頭市腫瘤醫院，內蒙古 包頭 014030）

肺癌是最常見的肺原發性惡性腫瘤，WHO統計每年新發肺癌病例120萬例，死亡110萬例[1]。其中，非小細胞肺癌約占肺癌的80%左右，大部分患者就診時已是晚期，總體5年生存率僅約15%。隨著標準一線化療方案療效出現了瓶頸，表皮生長因子酪氨酸及酶抑制劑（EGFR-TKIs）的臨床應用使晚期非小細胞肺癌EGFR突變患者得以延長生存期、提高生活質量。而表皮生長因子酪氨酸及酶抑制劑的應用有賴于EGFR基因突變檢測，以提高用藥有效率。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一種受體型酪氨酸激酶，在許多腫瘤中過表達和(或)發生突變，通過信號轉導控制腫瘤生長，并與新生血管生成、腫瘤的侵襲和轉移等密切相關，這些特點使其成為一個有潛力的腫瘤靶向治療分子[2]。本文旨在研究內蒙古包頭市蒙古族非小細胞肺腺癌患者與漢族非小細胞肺腺癌患者EGFR突變率是否存在差異，為內蒙古包頭市蒙古族晚期非小細胞肺腺癌患者個體化治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料：收集包頭市各醫院蒙古族肺腺癌患者石蠟包埋組織標本53例，其中男性33例，女性22例；年齡41～75歲，中位年齡59歲。漢族肺腺癌患者石蠟包埋組織標本55例，其中男性39例，女性16例；年齡38～76歲，中位年齡58歲。

1.2 方法

1.2.1 標本采集與DNA提?。菏灠駱吮局心[瘤組織占標本總體積的70%，采用病理石蠟切片樣品，切取10張石蠟包埋標本切片，每張面積＞10 mm×10 mm、厚度5～10 μm，（所用含有腫瘤組織的蠟塊切片保存時間不超過兩年）。常規石蠟切片，烤干后二甲苯脫蠟，無水乙醇浸泡再流水沖洗，干燥后顯微切割去除壞死組織，轉組織于Eppendorf管中，加消化緩沖液及蛋白酶K溶液，然后60 ℃水浴8～16 h，離心后取上清，加酚/氯仿(1∶1)混勻，離心取上清，加無水乙醇，-20 ℃放置后再離心棄上清，70%乙醇洗滌沉淀，室溫晾干后用ddH2O重新溶解沉淀，取1 μL測定濃度和純度，其余-80 ℃保存。

1.2.2 PCR擴增和測序：實時熒光PCR擴增 采用ARMS （amplification refractory mutation system，ARMS）方法進行PCR擴增，檢測EGFR基因外顯子18、19、20和21突變。用廈門艾德生物醫藥科技公司EGFR基因突變檢測試劑盒進行檢測，實驗具體操作步驟參照試劑盒說明書進行操作。采用StrataGene MX3000P實時PCR儀進行擴增，每次檢測樣品包括1個陽性質控品、1個NTC對照。如果Ct值為0或Ct值>30，則實驗結果判為野生型。所述熒光PCR的反應條件：95 ℃預變性5 min，1個循環；95 ℃變性25 s，64 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，15個循環；93 ℃變性25 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸20 s，31個循環。

1.3 統計學分析：采用SPSS 13.0統計軟件進行χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

檢測108例肺腺癌的樣本，包括53例內蒙古包頭市蒙古族和55例漢族肺腺癌的樣本。有46例EGFR基因突變，總突變率為42.59%。其中蒙古族突變22例，突變率為41.51%；漢族突變24例，突變率為43.64%。見表1。

表1 蒙古族與漢族EGFR基因突變統計結果

其中外顯子18檢測到EGFR基因突變1例，為漢族；外顯子19 檢測到EGFR基因突變34例，其中蒙古族16例、漢族18例；外顯子20 檢測到EGFR基因突變2例，其中蒙古族1例、漢族1例；外顯子21檢測到EGFR基因突變9例，其中蒙古族5例、漢族4例。外顯子19和外顯子21同時EGFR基因突變4例，其中蒙古族2例、漢族2例。見表1。

在外顯子19所檢測到34例EGFR基因突變中共有8種不同的突變形式，最常見核苷酸缺失起始位2235為14例，其中蒙古族為6例，漢族為8例；缺失起始位2238為5例，其中蒙古族為2例，漢族為3例。而核苷酸缺失終止位2249為9例，其中蒙古族為5例，漢族為4例。在外顯子21所檢測到9例EGFR基因突變中，其位點為2573位的T由G取代，導致EGFR第858位框架氨基酸由亮氨酸變為精氨酸（CTG→CGG，L858R）的為8例，蒙古族為3例，漢族為5例，二者的突變率無明顯差異。

3 討 論

表皮生長因子（EGF）及其位于細胞膜上的受體EGFR是一種跨膜蛋白質，是酪氨酸激酶erbB/HER家族的一個成員，主要由細胞外的結合區，跨膜區及酪氨酸激酶組成的細胞內區等3個區域組成。EGFR的異?？蓪е缕湎掠涡盘柾緩降漠惓＜せ睿罱K促使細胞的轉化、增殖、抵抗細胞凋亡，與腫瘤的發生、發展密切相關[3]。因此，EGFR成為腫瘤治療的重要靶分子。EGFR-TKI可阻斷EGFR誘導的體外腫瘤細胞的生長，用于非小細胞肺癌的治療。非小細胞肺癌對EGFR-TKI的敏感性與肺癌組織EGFR基因的突變呈密切相關。對藥物敏感的突變位點主要集中在外顯子18～21，約90%的突變集中在第19和第21外顯子，通過結構分析表明，該區域的突變改變了EGFR結構，影響多種蛋白激酶的自身調節[4-5]。

大規模臨床試驗已表明酪氨酸激酶抑制劑gefitinib]和erlotinib[6-8]在晚期非小細胞肺癌中的療效和生存上的優勢。文獻報道[9]，不同人種之間EGFR突變率不盡相同，東亞人群EGFR突變率30%左右，高加索人10%左右。Li等[10]通過對202例肺腺癌患者發現，我國漢族人的肺腺癌EGFR突變率為75.3%。單莉等[11]通過對68例維吾爾族和70例漢族肺腺癌樣本檢測發現維吾爾族肺腺癌EGFR突變率明顯低于我國漢族EGFR基因突變。而本研究顯示，內蒙古地區蒙古族肺腺癌EGFR突變與漢族肺腺癌EGFR突變表達無明顯差異，二者同樣適用EGFR-TKI治療。

肺癌組織EGFR基因的突變中約90%的突變集中在第19和第21外顯子。本研究45例EGFR基因突變中檢測到33例外顯子19基因突變，共有8種不同的突變形式，最常見核苷酸缺失起始位2235為14例，其中蒙古族為6例，漢族為8例，缺失起始位2238為6例，其中蒙古族為3例，漢族為3例，而核苷酸缺失終止位2249為11例，其中蒙古族為5例，漢族為6例，二者均無統計學差異。在外顯子21所檢測到9例EGFR基因突變中，其位點為2573位的T由G取代，導致EGFR第858位框架氨基酸由亮氨酸變為精氨酸（CTG→CGG，L858R）的為8例，蒙古族為3例，漢族為5例，二者的突變率無明顯差異。

綜上所述，本研究表明內蒙古包頭市蒙古族肺腺癌患者EGFR基因突變率與漢族EGFR基因突變率無統計學差異。非小細胞肺癌對EGFR-TKI的敏感性與肺癌組織EGFR基因的突變呈密切相關，基于EGFR的突變情況來選擇EGFR-TKIs的藥物進行化療已成為臨床醫師的共識，本研究首次提供內蒙古包頭市蒙古族肺腺癌EGFR突變率信息，可以為臨床醫師提供有益參考，使廣大肺腺癌患者受益。

[1] Zhou QH.Progress in early diagnosis and screening of lung cancer[J].Chin Cancer,2009,18(9):705-712.

[2] Jorissen RN,Walker F,Pouliot N,et al.Epidermal growth factor receptor: mechanisms of activation and signaling[J].Exp Cell Res,2003,284(1):31-53.

[3] Yarden Y.The EGFR family and its ligands in human cancer signaling mechanisms and therapeutic opportunities[J].Eur J cancer,2001,37(Suppl4):3-8.

[4] Lynch TJ,Bell DW,Sordella R,et al.Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small lung cancer to gefitinib[J].N Engl J Med,2004,350(21):2129-2139.

[5] Dickson NR,Hainsworth JD,Bradof D,et al.Single agent gefitinib in poor performance status patients with previously untreated advanced non-small lung cancer:A Minnie Pearl Cancer Research Network phase Ⅱ study [J].Proc Am Soc Clin Oncol,2004,23(634):7086.

[6] Fukuoka M,Yano S,Giaccone G,et al.Multi-institutional randomized phase II trial of gefitinib for previously treated patients with advanced non-small-cell lung cancer(TheIDEAL 1 Trial)[J].J Clin Oncol,2003,21(12): 2237-2246.

[7] Kris MG,Natale RB,Herbst RS,et al.Efficacy of gefitinib,an inhibitor of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase,in symptomatic patients with non-small cell lung cancer: a randomized trial[J].JAMA,2003,290(16):2149-2158.

[8] Thatcher N,Chang A,Parikh P,et al.Gefitinib plus best supportive care in previously treated patients with refractory advanced non-small-cell lung cancer: results from a randomized,placebocontroller,multicentre study(Iressa Survival Evaluation in Lung Cancer)[J].Lancet,2005,366(9496):1527-1537.

[9] Wu YL,Zhong WZ,LiL Y,et al.Epidermal growth factor receptor mutations and Their correlation with Gefitinib thera-py in patients with non-small cell lung cancer:A meta-a-nalysis based on updated individual patient data from six medical centers In mainland China[J]. J Thorac Oncol,2007,2(5):430-439.

[10] Li C,Fang R,Sun Y,et al.Spectrum of oncogenic driver mutations in lung adenocarcinomas from East Asian never smokers[J].PLoS One,2011,6(11): e28204.

[11] 單莉,張琰,趙峰,等.維吾爾族肺腺癌患者的EGFR基因突變分析[J].中國肺癌雜志,2013,16(2):78-81.