過氧化氫通過上調高遷移率族蛋白損傷心肌的實驗研究

馬瑞松，李元紅，周曉亞，江洪，胡笑容

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論著·基礎

過氧化氫通過上調高遷移率族蛋白損傷心肌的實驗研究

馬瑞松，李元紅，周曉亞，江洪，胡笑容

目的 探討過氧化氫(H2O2)通過高遷移率族蛋白(HMGB1)介導對心肌損傷的作用機制。方法 胎鼠心肌細胞培養后，分為4組：對照組，H2O2不同濃度組(100 μmol/L、200 μmol/L、500 μmol/L)，H2O2(200 μmol/L)+乙酰半胱氨酸(NAC，200 μmol/L)組，H2O2(200 μmol/L)+HMGB1抗體(20 μg/ml)組。檢測心肌細胞活性、凋亡率、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)、HMGB1表達。結果 (1)細胞活性:與對照組比較，心肌細胞活性隨著H2O2濃度的增加而降低(t=-5.81，-9.59，-14.21，P均<0.05)；NAC和HMGB1抗體可以明顯減弱H2O2(200 μmol/L)對細胞活性的抑制作用(t=-2.98，-3.03,P<均0.05)。(2)LDH和CK的表達水平：與對照組比較，LDH和CK的表達量隨著H2O2的濃度增加而增加(tLDH=9.78，15.37，18.13，tCK=11.29，20.35，26.17，P均<0.05)。與H2O2(200 μmol/L)組比，NAC和HMGB1抗體可以抑制LDH和CK的表達(tLDH=-4.91,-4.22,tCK=-4.17,3.29，P均<0.05)。(3)MDA表達和SOD活性：H2O2(100，200，500 μmol/L)可以抑制心肌細胞SOD活性，增加MDA表達(tSOD=-4.16，-6.59，-10.76，tMDA=3.98，5.16，9.47，P均<0.05)；與H2O2(200 μmol/L)組比，NAC和HMGB1抗體可以拮抗H2O2對SOD和MDA的影響(tLDH=-4.91,-4.22,tCK=-4.17，3.29，P均<0.05)。(4) HMGB1的表達：與對照組比較，H2O2(100，200，500 μmol/L)可明顯增加心肌中HMGB1的表達(t=12.94，21.08，25.81，P均<0.05)，與H2O2(200 μmol/L)組比，NAC+ H2O2和HMGB1-Ab+ H2O2中HMGB1的表達明顯降低(t=-10.24，-8.09，P均<0.05)。(5)心肌凋亡：與對照組比較， H2O2組(100、200、500 μmol/L)心肌凋亡率明顯增加(t=7.52，13.06，16.61，P<0.05)；NAC+H2O2組和HMGB1+H2O2組心肌凋亡率較H2O2(200 μmol/L)組明顯增加(t=-4.89，-4.23，P<0.05)。結論 H2O2誘導的氧化應激反應可以通過上調HMGB1表達，損傷心肌。

過氧化氫；高遷移率組蛋白；心肌損傷；胎鼠

心肌缺血再灌注或缺氧再復氧能夠導致機體內的免疫細胞釋放大量活性氧(ROS)和促炎細胞因子(如TNF-α、IL-1、IFN-γ等)。心肌中活性氧生成的關鍵酶是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶和黃嘌呤氧化酶[1]，乙酰半胱氨酸(NAC)可以降低NADPH氧化酶的活性，減少ROS的生成[2]。心肌細胞中ROS能夠引起氧化應激及氧化損傷，過氧化氫(H2O2)作為一種常見的活性氧也參與了其中。氧化應激參與了心血管系統多種疾病的發生、發展，包括心肌缺血再灌注損傷，可導致細胞凋亡或壞死。

高遷移率族蛋白(High mobility group protein，HMGB1)是一種非組織核蛋白，由激活的免疫細胞或壞死細胞釋放，作為促炎因子可加重心肌缺血再灌注損傷[3，4]。2002年Scafidi等[5]在研究中提出HMGB1是壞死和凋亡細胞是否發生炎性反應的關鍵信號。Tsung等[6]在肝臟I/R模型中發現，ROS可能參與了HMGB1的產生和釋放，肝細胞在過氧化氫作用下HMGB1表達明顯增加，而加入了抗氧化劑后可以顯著抑制HMGB1的釋放。據此我們推測在心臟I/R中，HMGB1可能參與了氧化應激對心肌的損傷。本文觀察HMGB1在心肌缺血缺氧時的表達機制，為預防各種心肌缺血后氧化應激炎性反應提供新的思路，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 從胎鼠心臟分離心肌細胞[7]。迅速將離體心臟剪碎、消化和漂洗。心肌細胞以1.0×106/ml的濃度溶于含10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素(100 U/ml)，1%鏈霉素(100 μg/ml)的DMEM液中。在5%CO2高濕度的37℃恒溫培養箱里培養4 d。

1.2 實驗分組 將培養細胞分為如下4組：(1)對照組，只加入含15%FBS的DMEM-F12培養基；(2)H2O2不同濃度組，加入無血清DMEM培養基，加入過氧化氫濃度分別為低100 μmol/L、中200 μmol/L、高500 μmol/L；(3)H2O2+NAC組，先以NAC(200 μmol/L)預處理心肌細胞30 min，后加入H2O2(200 μmol/L)共同孵育24 h；(4)H2O2+HMGB1抗體組，用HMGB1抗體16(IBL，德國，20 μg/ml)預處理心肌細胞30 min，后加入H2O2(200 μmol/L)共同孵育24 h。

1.3 測定項目 (1)細胞活性：心肌細胞接種于96孔板，調整濃度至1×105/ml培養4 d后，用細胞計數試劑盒(CCK-8，Dojindo，日本)測定細胞活性。按照試劑盒說明規范操作。選擇波長490 nm，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值。細胞活性以測試組平均吸光度值/對照組平均吸光度值×100%表示。(2)酶類氧化指標測定：乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)，測定細胞培養液中LDH和CK的含量反映細胞損傷程度。選用南京建成生物實驗研究所的LDH和CK的ELISA試劑盒，根據說明規范操作。測定超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)表達，反映了氧化應激損傷的程度。選用南京建成生物實驗研究所的試劑盒測定，根據說明規范操作。(3)免疫印跡法測定HMGB1的表達量：按文獻[8]方法測定培養細胞中HMGB1的表達量，以HMGB1與GADPH的比值反映HMGB1的表達量。(4)流式細胞儀測定細胞凋亡： 流式細胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡。分離培養的細胞，PBS漂洗后懸浮于500 μl結合緩沖液，然后加入5 μl的Annexin V和5μl的PI，流式細胞儀檢測，Annexin V為藍色熒光，PI為紅色熒光。

1.4 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以均值±標準差表示，組間比較用t檢驗，多組間采用單因素方差分析或Welch檢測，組間兩兩比較用Dunnett T3檢測。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 細胞活性 與對照組比較，隨著H2O2濃度的增加心肌細胞活性降低(t=-5.81、-9.59、-14.21，P均<0.05)；NAC和HMGB1抗體可以明顯減弱H2O2(200 μmol/L)對細胞活性的抑制作用(t=-2.98，-3.03,P<均0.05)；而NAC+ H2O2(200 μmol/L)和HMGB1抗體+ H2O2(200 μmol/L)組間無統計學差異(t=1.09,P>0.05)。見圖1。

注：與對照組比較，aP<0.05；與H2O2(200 μmol/L)組比較，bP<0.05

2.2 LDH、CK的表達水平及SOD、MDA表達 與對照組比較，隨著H2O2的濃度增加LDH和CK的表達量增加(tLDH=9.78、15.37、18.13，tCK=11.29、20.35、26.17，P均<0.05)。與H2O2(200 μmol/L)組比，NAC和HMGB1抗體可以抑制LDH和CK的表達(tLDH=-4.91、-4.22,tCK=-4.17、3.29，P均<0.05)。見圖2。

MDA表達和SOD活性：H2O2(100、200、500 μmol/L)可以抑制心肌細胞SOD活性，增加MDA表達(tSOD=-4.16、-6.59、-10.76，tMDA=3.98、5.16、9.47，P均<0.05)；與H2O2(200μmol/L)組比，NAC和HMGB1抗體可以拮抗H2O2對SOD和MDA的影響(tLDH=-4.91、-4.22,tCK=-4.17、3.29、P均<0.05)，見圖3。

2.3 HMGB1的表達 與對照組比較，H2O2(100、200、500 μmol/L)可明顯增加心肌中HMGB1的表達(t=12.94、21.08、25.81，P均<0.05)，與H2O2(200 μmol/L)組比，NAC+ H2O2和HMGB1-Ab+ H2O2中HMGB1的表達明顯降低(t=-10.24、-8.09，P均<0.05)。見圖4。

注：與對照組比較，aP<0.05；與H2O2(200 μmol/L)組比較，bP<0.05

注：與對照組比較，aP<0.05；與H2O2(200 μmol/L)組比較，bP<0.05

2.4 心肌凋亡 與對照組比較，H2O2組(100、200、500 μmol/L)心肌凋亡率明顯增加(χ2=7.52、13.06、16.61，P<0.05)；NAC+ H2O2和HMGB1+ H2O2組心肌凋亡率較H2O2(200 μmol/L)組明顯增加(χ2=-4.89、-4.23，P<0.05)。見圖5。

3 討 論

本文發現:(1)H2O2作為一種活性氧，可以抑制心肌細胞活性，增加LDH和CK的表達，且呈劑量依賴性。同時，H2O2還可以抑制SOD活性，增加MDA表達；(2)H2O2可以促進HMGB1的表達和心肌細胞凋亡，且呈劑量依賴型；(3)NAC-NADPH氧化酶抑制劑，可以拮抗H2O2的作用，增加心肌細胞活性、抑制HMGB1表達，以及減少心肌凋亡率，這就提示我們抗氧化劑在對抗ROS侵襲的過程中也許能夠通過抑制HMGB1的釋放來減輕心肌細胞的損傷；(4)HMGB1抗體可以通過抑制HMGB1表達保護心肌，可以減弱H2O2的細胞損傷和促凋亡作用。

注：與對照組比較，aP<0.05；與H2O2(200 μmol/L)組比較，bP<0.05

注：與對照組比較，aP<0.05；與H2O2(200 μmol/L)組比較，bP<0.05

心肌缺血再灌注可以通過線粒體途徑以及激活中性粒細胞和巨噬細胞引起ROS過度產生，從而加重心肌I/R損傷，外源性活性氧(如H2O2)同內源性ROS一樣可以加重心肌I/R損傷。有研究已證實，ROS引起細胞損傷主要與脂質過氧化、促細胞凋亡和鈣超載有關[9]，而鈣超載主要是由于脂質過氧化引起生物膜破壞和肌漿網鈣泵功能破壞所致，故可理解為脂質過氧化的繼發損害。脂質過氧化可以引起細胞膜以及細胞器膜流動性改變，破壞膜酶和離子通道的微環境，損壞呼吸鏈，進而導致細胞的損傷。SOD是內源性抗氧化系統中關鍵酶，MDA是脂質過氧化產物，CK和LDH是心肌損傷標記物，H2O2抑制SOD活性，增加MDA、CK和LDH的表達，印證了脂質過氧化損傷的結論，但同時本研究發現，NAC和HMGB1抗體可一定程度地增加SOD活性，減少MDA、CK和LDH的表達，即減弱H2O2的脂質過氧化和心肌損傷作用。ROS可通過直接損傷細胞DNA、影響線粒體信號通路以及激活核因子κB(NF-κB)誘導細胞凋亡。本研究發現，H2O2可明增加心肌細胞凋亡指數，且呈劑量依賴型，而NAC和HMGB1抗體可降低心肌凋亡指數，即減弱H2O2的促細胞凋亡作用。另外，本結果發現HMGB1表達量的增高程度與氧化應激對心肌細胞的損傷程度呈正相關。有研究已證實，HMGB1作為促炎因子，可以促進細胞凋亡和炎性反應加重心肌缺血再灌注損傷，且呈劑量依賴型[10～12]。而HMGB1是一種非組織核蛋白，當細胞壞死時被釋放出來，可進一步加重炎性反應和細胞凋亡。2002年Scaffidi等[5]證實，缺失了HMGB1壞死細胞將不能誘導促炎因子的釋放。這些結果均提示，由ROS誘導的損傷和壞死心肌細胞可以釋放HMGB1，而HMGB1可進一步加重心肌細胞的炎性反應和凋亡。由此可以推斷，HMGB1參與了H2O2引起的心肌損傷作用。

HMGB1引起心肌缺血再灌注損傷的機制，目前主流研究認為，HMGB1是一種新型的促炎因子，參與了心肌I/R損傷，同時還可以促進其他炎性因子的表達，如TNF-α、IL-6；當抑制HMGB1的表達時，會減少TNF-α、IL-6的表達且減輕心肌I/R損傷[13]。近期Zhu等[10]的研究證實了HMGB1-TLR4-IL-23-IL-17A軸可以通過促進心肌細胞凋亡、中性粒細胞聚集加重心肌I/R損傷。Xiong等[14]的研究證明抑制HMGB1的表達可以減輕心肌I/R損傷的結論。心肌細胞凋亡是心肌I/R損傷的一個重要的病理生理過程。Hu等[12]的研究進一步證明，在心肌I/R中，HMGB1可以促進心肌細胞凋亡，且呈劑量依賴性。

研究發現，ROS可以激活炎性反應通路NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)進而調控下游炎性因子TNF-α、IL-6等誘導凋亡發生[6，15～17]。HMGB1既可以調控炎性因子TNF-α、IL-6的表達，也參與了心肌細胞凋亡過程，這可能是HMGB1參與H2O2心肌損傷作用的機制，但具體機制仍待進一步研究。

ROS與HMGB1的關系前期已有相關研究。Marshall等[18]證實，H2O2可以誘導培養的胎鼠心肌細胞釋放HMGB1；米諾環素和丙酮酸乙酯可以通過抑制HMGB1表達減弱ROS對心肌I/R的損傷[19，20]。另外，在系統性紅斑狼瘡中ROS可以明顯增加細胞外HMGB1的活性進而激活白細胞加重炎性反應[21]；在肺組織中，ROS可以誘導支氣管上皮細胞HMGB1的移位和釋放[22]；而HMGB1抗體可明顯減弱ROS性引起的肺組織炎性反應和急性肺損傷[23]。同時，本實驗發現抗氧化劑NAC可以抑制H2O2誘導的HMGB1高表達，HMGB1抗體可以通過抑制HMGB1，減弱H2O2對心肌細胞損傷作用，進一步印證了上述結論。

綜上，我們可以推斷：H2O2可以通過上調HMGB1的表達增加心肌缺血再灌注損傷。但關于ROS對HMGB1的調控作用和促心肌損傷作用的具體機制仍需進一步研究。本文為臨床上預防或減弱ROS導致的心肌損傷提供了新的思路。

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Hydrogen peroxide worsen myocardial injury via up regulating HMGB1 expression:an experimental study

MARuisong*,LIYuanhong,ZHOUXiaoya,JIANGHong,HUXiaorong.DepartmentofCardiology,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China

Correspondingauthor:LIYuanhong,E-mail:lyh0101@vip.163.com

Objective To investigate the effect of hydrogen peroxide (H2O2) by high mobility group protein (HMGB1) mediated mechanism of myocardial injury.Methods Fetal rat myocardial cells cultured and divided into 4 groups: control group, H2O2different concentration group (100 μmol / L, 200 μmol / L, 500 μmol / L), H2O2(200 μmol / L) + N-acetylcysteine (NAC, 200 μmol / L) group, H2O2(200 μmol / L) +HMGB1 antibody (20 ug / ml) group. The activity of myocardial cells, apoptosis rate, lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase (CK), superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) and HMGB1 expression were detected.Results (1) Cell activity: compared with the control group, myocardial cell activity along with the increase of H2O2concentration were decrease (t=-5.81,t=9.59,t=-14.21, allP<0.05); NAC and HMGB1 antibodies can be significantly reduced H2O2(200 umol / L) on the activity of cell inhibition (t=-2.98,t=-3.03,P<0.05). (2) The expression level of LDH and CK: compared with the control group, the expression of LDH and CK were increased along with the increase of the H2O2concentration (LDH,t=9.78,t=15.37,t=18.13. CK,t=11.29,t=20.35,t=26.17, allP<0.05). Compared with H2O2(200 umol / L) group, NAC and HMGB1 antibodies can inhibit LDH and CK expression (LDH,t=-4.91,t=-4.22, CK,t=-4.17,t=3.29, allP<0.05). (3) The expression of MDA and SOD activity: H2O2(100, 200, 500 umol / L) can inhibit the activity of SOD of myocardial cells, increase the expression of MDA (SOD,t=-4.16,t=-6.59,t=-10.76, MDA,t=3.98,t=5.16,t=9.47,P<0.05); H2O2(200 umol / L) group, NAC and HMGB1 antibodies can antagonize the H2O2on superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) (LDH,t=-4.91,t=-4.22, CK,t=-4.17,t=3.29, allP<0.05). (4) The expression of HMGB1: compared with the control group, H2O2(100, 200, 500 umol / L) can be significantly increased myocardial HMGB1 expression (t=12.94,t=21.08,t=25.81,P<0.05), and compared with H2O2(200 umol / L) group, NAC + H2O2and HMGB1-Ab+ H2O2’s expression of HMGB1 were decreased significantly (t=-10.24,t=-8.09, allP<0.05). (5) myocardial apoptosis: compared with the control group, H2O2group’s (100, 200, 500 u mol / L) myocardial apoptosis rate increased significantly (t=7.52,t=13.06,t=16.61,P<0.05); NAC+ H2O2and HMGB1+ H2O2groups’ myocyte apoptosis rate were higher than that of H2O2group (200 umol / L) (t=-4.89,t= -4.23,P<0.05).Conclusion The response to oxidative stress induced by H2O2can up regulate the expression of HMGB1, myocardial injury.

Hydrogen peroxide;Myocardial injury；Fetal rat

國家自然科學基金資助課題(No.81370308)

430060 武漢大學人民醫院心內科(馬瑞松、周曉亞、江洪、胡笑容)； 445000 恩施土家族苗族自治州中心醫院 心內科(李元紅)

李元紅，E-mail:lyh0101@vip.163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.06.001

2015-02-14)