鈣絡合劑BAPTA-AM對胞外酸化誘導大鼠關節軟骨細胞自噬作用的影響及其可能機制

高文凡，陳飛虎，葛金芳，鄧子云，雷 靜，周仁鵬，王志森

(安徽醫科大學藥學院，安徽 合肥 230032)

鈣絡合劑BAPTA-AM對胞外酸化誘導大鼠關節軟骨細胞自噬作用的影響及其可能機制

高文凡，陳飛虎，葛金芳，鄧子云，雷 靜，周仁鵬，王志森

(安徽醫科大學藥學院，安徽 合肥 230032)

目的 觀察 BAPTA-AM 對胞外酸化誘導大鼠關節軟骨細胞自噬作用的影響，探討其可能的作用機制。方法 體外使用胰酶-Ⅱ型膠原酶消化法分離提取大鼠關節軟骨細胞，分為正常組(pH 7.4)、酸化組(pH 6.0)、以及分別經 BAPTA-AM 處理的正常組和酸化組，激光共聚焦技術檢測軟骨細胞胞內鈣離子變化，實時熒光定量 PCR 法檢測細胞自噬基因 Beclin-1、ULK1 mRNA 的表達，Western blot 法檢測自噬蛋白 LC3 的表達，吖啶橙染色分析細胞自噬溶酶體形成情況。結果 與 pH 7.4 正常組比較，pH 6.0 酸化刺激明顯增加大鼠關節軟骨細胞內 Ca2+的濃度，且自噬標志物 Beclin-1、ULK1 mRNA 及 LC3Ⅱ 蛋白表達均明顯升高，酸性自噬溶酶體形成增多，同時酸化刺激能引起 CaMKKβ 及 p-AMPK 蛋白表達水平增高，磷酸化蛋白 p-mTOR 水平明顯降低。BAPTA-AM 酸化組自噬水平和 CaMKKβ 及 p-AMPK 表達明顯降低，p-mTOR 表達明顯升高。結論 BAPTA-AM 能明顯減弱胞外酸化誘導軟骨細胞自噬作用，其機制可能與抑制胞內Ca2+有關。

BAPTA-AM；類風濕關節炎；關節軟骨細胞；細胞自噬；Ca2+；胞外酸化

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA) 是一種慢性、系統性不明病因的自身免疫性疾病，嚴重威脅著人類的健康，其中關節軟骨和骨組織破壞是其致殘的根本原因[1]。軟骨細胞作為關節軟骨內唯一存在的細胞類型，其在軟骨細胞外基質 (extracellar matrix, ECM) 的合成及修復中發揮著關鍵作用。在RA等一些病理條件下，軟骨細胞代謝異?？梢灾苯訉е玛P節軟骨結構和功能的改變。自噬(autophagy)是一種細胞依賴溶酶體的自我代謝過程，通過更新和降解一些長壽命、錯誤折疊的蛋白質和受損的細胞器等來維持細胞內環境的穩態[2]。眾多學者研究發現，自噬活化不僅可以為細胞提供能量抵御代謝應激等保護作用，同時亦發現其與多種疾病的發生發展有關，受到廣泛關注[3]。且有研究證實，在RA進程中存在著自噬的活化，但是軟骨細胞自噬的活化在RA進程中具體的保護或破壞作用目前仍然存在著爭議[4]。

BAPTA-AM [1，2-bis ( 2-aminophenoxy) ethane-N，N，N′N′-tetraacetic acid]是一種高選擇性高效的鈣絡合劑，廣泛被用于控制細胞內鈣水平，能有效降低細胞內鈣離子濃度，是一種公認的科研工具藥物[5]。研究發現，細胞內游離鈣離子與細胞自噬有著密切的關系，游離鈣離子既可以誘導自噬的活化，亦可抑制自噬的發生，其具體的作用尚不明確[6]。

本課題組前期研究結果表明，胞外酸化(pH 6.0)可以明顯誘導大鼠關節軟骨細胞自噬的發生，但機制不明[7]。本研究以大鼠關節軟骨細胞為實驗對象，胞外酸化誘導細胞自噬活化，探究 BAPTA-AM 對軟骨細胞自噬作用的影響及其可能機制，揭示胞外酸化誘導軟骨細胞自噬過程細胞內游離鈣離子濃度[Ca2+]i與細胞自噬的可能關系。 1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF 級 Sprague-Dawley(SD)大鼠，♂，體質量180～200 g，購自安徽醫科大學實驗動物中心，合格證號：皖動準字 01 號。

1.2 藥物與試劑BAPTA-AM 購自日本 Dojindo 公司(C34H40N2O18，分子量764.68)；抗 LC3 抗體購自 Cell Signaling Technology 公司；抗 AMPKa1 抗體、抗 p-AMPKa1 抗體和抗 CaMKKβ 抗體購自 Biosynthesis 公司；抗 β-actin 抗體、抗 mTOR 抗體和抗 p-mTOR 抗體購自 Santa Cruz 公司；胎牛血清購自Gibco 公司；Ⅱ型膠原酶購自 Sigma 公司；高糖 DMEM 液體培養基購自 Hyclone 公司；辣根酶標記山羊抗兔 IgG 為北京中杉金橋公司產品；胰蛋白酶消化液、D-Hanks 液購自碧云天公司； TRIzol 試劑購自 Invitrogen 公司；逆轉錄試劑盒、PCR 擴增試劑盒和 SYBR Green 染料購自 Fermentas 公司；ECL 顯色試劑盒購自 Thermo Scientific 公司。

1.3 大鼠關節軟骨細胞分離、培養按本實驗室常規方法進行大鼠關節軟骨細胞的分離[8]，接種入細胞培養瓶中。置于 37℃、5 % CO2孵育箱中培養 48 h 后首次換液。每隔 2～3 d更換培養液 1 次，倒置顯微鏡下觀察細胞。當培養的軟骨細胞鋪滿培養瓶底 70%～90 %時，即可開始實驗。

1.4 軟骨細胞自噬誘導及藥物處理軟骨細胞分組如下：pH 7.4 正常組、 pH 6.0 酸化組、 pH 7.4 + BAPTA-AM (10 μmol·L-1)組、pH6.0 + BAPTA-AM(10 μmol·L-1) 組。細胞給予相應處理后，酸化處理組加入 pH 6.0 的培養基培養 3 h，收集細胞，檢測 BAPTA-AM 對酸化誘導的軟骨細胞自噬的影響。

1.5 激光共聚焦檢測大鼠關節軟骨細胞內 Ca2+ 濃度將軟骨細胞接種于激光共聚焦專用細胞培養皿中，藥物處理后，用 Hanks 液沖洗 2 遍, 將10 μmol·L-1Fluo-3/AM 和 0.02% F-127 的 100 μL 混合工作液滴于平皿中央, 37℃、5 % CO2培養箱中避光孵育 30 min, 再用 Hanks 液沖洗蓋玻片 3 遍，保留少許 Hanks 液于皿內平衡細胞 10 min，于10 min 內檢測細胞內 Ca2+濃度。激光共聚焦顯微鏡下動態掃描細胞 20 s，用微量加樣器將 pH 6.0 的細胞外液滴注到平皿中，動態觀察胞內 Ca2+的熒光強度變化。激發光波長為 488 nm、發射光波長 525 nm。

1.6 軟骨細胞自噬水平檢測

1.6.1 實時熒光定量 PCR檢測軟骨細胞 Beclin-1 、ULK1 mRNA 表達 實驗分組同“1.4”。相應藥物處理后，按 TRIzol 三步法提取細胞總 RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書和引物反應條件進行逆轉錄和目的基因擴增，GAPDH 為內標。引物序列詳見 Tab 1。反應體系為 10 μL，其中 SYBR Green Mix (2×) 5 μL， cDNA 0.5 μL，引物各 0.3 μL，用無酶水補足。反應條件為：Step1：95℃，10 min; Step2：95℃，15 s； 60 ℃，30 s；72℃，30 s; 45 cycles。

1.6.2 Western blot 法檢測自噬蛋白 LC3 的表達 實驗分組同“ 1.4”。相應藥物處理后，棄培養液，用預冷 PBS 洗滌 3 遍，每瓶加入 400 μL RIPA 裂解液(含 10 % PMSF)裂解 30 min，細胞轉移到 1.5 mL EP 管中，離心取上清，使用 BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。將上清與上樣緩沖液按 4 ∶1的比例進行分裝，100℃煮10 min 變性，-80℃保存待用。等量的蛋白樣品進行 SDS-PAGE 膠分離后轉移至PVDF 膜。TBST 洗脫 10 min。室溫下用含 5 % 脫脂奶粉(TBST 溶解)封閉 3 h。隨后加入一抗(1 ∶500)4℃孵育過夜。TBST 洗脫 3 次，加入相應的二抗，孵育 1 h，漂洗 3 次。將 PVDF 膜用化學發光劑 ECL 染色，曝光拍照。結果采用 Image-Pro Plus 圖像分析管理系統分析。

Tab 1 Oligonucleotide primer sequences used for quantitative real-time PCR analysis

1.6.3 吖啶橙(acridine orange，AO)染色分析酸性自噬囊泡 實驗分組同“1.4”。相應處理后，PBS 洗滌2次，用AO染液進行染色(最終濃度為 2 mg·L-1)，室溫避光 15 min，然后用 PBS 洗滌 2 次，熒光顯微鏡觀察酸性囊泡自噬體。

1.7 Western blot 法檢測CaMKKβ、AMPKa1、p-AMPKa1、mTOR、p-mTOR蛋白的表達實驗分組同“1.4”。試驗步驟同“1.6.2”。

2 結果

2.1 BAPTA-AM 對胞外酸化誘導大鼠關節軟骨細胞自噬的影響

2.1.1 BAPTA-AM 對LC3 蛋白表達的影響 Western blot 結果如Fig 1所示，與 pH 7.4 正常組相比，酸化刺激組 ( pH 6.0 ) 軟骨細胞 LC3Ⅱ 蛋白表達明顯增加，且差異具有顯著性(P<0.01)。與酸化組比較，BAPTA-AM 處理組可明顯下調LC3Ⅱ 蛋白水平(P<0.01)，但是 BAPTA-AM對正常組細胞的 LC3Ⅱ 蛋白表達無明顯影響。

2.1.2 BAPTA-AM 對 Beclin-1、ULK1 mRNA 表達的影響 如Fig 2 所示，酸化刺激組 (pH 6.0) 大鼠關節軟骨細胞 Beclin-1、ULK1 mRNA 表達與正常組相比較明顯增加(P<0.01)。與酸化組比較，BAPTA-AM 處理組可明顯降低 pH 6.0 組細胞 Beclin-1、ULK1 mRNA 表達(P<0.01)。

2.1.3 BAPTA-AM 對自噬囊泡的影響 AO染色觀察自噬關鍵的形態學特征酸性自噬溶酶體的形成，結果如 Fig 3 所示，與正常組(Fig 3A)相比，pH 6.0酸化刺激能明顯增加酸性自噬溶酶體的形成(Fig 3C)；BAPTA-AM 能夠明顯減少酸性自噬溶酶體的形成(Fig 3D)。

Fig 1 Effects of BAPTA-AM on expressions of LC3 in acid-induced articular chondrocytes(n=3)

**P<0.01vspH 7.4 normal group；##P<0.01vspH 6.0 group

Fig 2 Effects of BAPTA-AM on expressions of Beclin-1 and ULK1 in acid-induced articular chondrocytes(n=3)

**P<0.01vspH 7.4 normal group；##P<0.01vspH 6.0 group

2.2 BAPTA-AM 對胞外酸化誘導大鼠關節軟骨細胞內鈣離子的影響激光共聚焦結果顯示，pH 7.4 正常組軟骨細胞，前、中、后各時段大鼠關節軟骨細胞熒光強度基本沒有變化(Fig 4A)；給予 BAPTA-AM 后對細胞胞質 Ca2+濃度無明顯影響(Fig 4B)。pH 6.0 酸化刺激組軟骨細胞，酸化刺激前細胞胞質 Ca2+濃度無明顯變化，酸化刺激導致細胞 Ca2+明顯增強，隨后熒光開始減弱(Fig 4C)；在給予 BAPTA-AM 后，酸化刺激對細胞胞質 Ca2+影響較小(Fig 4D)；數據分析后結果顯示，正常組細胞熒光變化曲線接近平坦，酸化誘導的關節軟骨細胞中熒光曲線先明顯升高后降低，BAPTA-AM 處理后軟骨細胞中熒光曲線較酸化組平坦。

Fig 3 Effects of BAPTA-AM on acid-induced acidic vesicle formation of autophagic vacuoles of articular chondrocytes

A: pH 7.4 normal group; B: pH 7.4+ BAPTA-AM group; C: pH 6.0 group; D: pH 6.0+BAPTA-AM group

Fig 4 Effects of BAPTA-AM on acid-induced elevation of [Ca2+]i in articular chondrocytes

1: Before exposure to acid solution; 2: Increased Ca2+intensity when pH was decreased to 6.0; 3: A few minutes after exposure to the acid solution. A: pH 7.4 normal group; B: pH 7.4+BAPTA-AM group; C: pH 6.0 group; D: pH 6.0+BAPTA-AM group

2.3 CaMKKβ、AMPK、mTOR在 BAPTA-AM調控大鼠關節軟骨細胞自噬中的作用Western blot結果如Fig 5所示，與 pH 7.4正常組比較，酸化刺激組大鼠關節軟骨細胞 CaMKKβ、p-AMPK 蛋白表達均明顯增加，p-mTOR 蛋白表達明顯降低，且差異有統計學意義(P<0.01)。與酸化組相比，BAPTA-AM組可明顯抑制CaMKKβ、p-AMPK蛋白表達，升高 p-mTOR 蛋白表達(P<0.01)。

Fig 5 Effects of BAPTA-AM on expressions of CaMKKβ, AMPK and mTOR in articular chondrocytes(n=3)

**P<0.01vspH 7.4 normal group；#P<0.05,##P<0.01vspH 6.0 group

3 討論

自噬是一種溶酶體依賴的細胞降解過程，通過將自噬小體中的細胞“貨物”轉移至溶酶體，自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，隨后自噬溶酶體的“貨物”開始降解，這種細胞內的“貨物”可以是一些錯誤折疊的大分子蛋白、脂類以及完整的細胞器等[9]?；A水平的自噬可以維持細胞的穩態和自身代謝[10]。同時自噬可在一些應激條件下被激活，如低氧、營養缺失、熱休克、微生物感染、酸化等[11-12]。這些情況下，自噬可以為細胞提供構建成分，并納入一些新合成的大分子為細胞抗應激反應和能源生產所需，確保細胞的生存。近年來大量研究表明，自噬與多種疾病的發生發展有關，如炎癥、神經退行性疾病、腫瘤等[3]。在RA中，也存在著自噬的活化，但具體機制尚不明確[4]。RA 關節局部組織酸化導致的關節軟骨和骨質的破壞是其致殘的主要原因[8]。本課題組前期研究表明，pH 6.0 酸化條件能明顯激活軟骨細胞自噬，自噬標志性蛋白 LC3Ⅱ 表達明顯升高，但具體機制尚不明確[7]。同時也有研究表明，鈣離子在細胞自噬過程中發揮重要作用，但是具體誘導自噬或抑制自噬目前尚存在著爭議[6]。

本文以大鼠關節軟骨細胞為實驗對象，pH 6.0 胞外酸化為誘導自噬活化條件，使用 Ca2+絡合劑 BAPTA-AM，探討 Ca2+在胞外酸化誘導軟骨細胞自噬中的作用。實驗結果顯示，胞外酸化大鼠關節軟骨細胞可以誘導自噬活化，酸化刺激組加入 BAPTA-AM 后，胞內游離鈣離子水平下降，并且自噬標志物 LC3Ⅱ、Beclin-1、ULK1 表達水平明顯降低，提示 Ca2+可能參與胞外酸化誘導的軟骨細胞自噬，同時，BAPTA-AM 處理后正常組自噬水平并無明顯改變，這與 Furuta等[5]研究結果相一致。

Ca2+作為細胞內重要的第二信使，與細胞內一些重要的生理病理過程具有密切的聯系，其微小的改變都可以影響到細胞的正常生理功能。Ca2+的信號通路有很多組件，這些組件可以相互連接來創建一個廣泛的空間和時間信號[13]。研究表明，升高的細胞質Ca2+及一系列信號通路在自噬中發揮著重要作用[14]，同時有研究表明，mTOR作為一個細胞的重要信使，在自噬激活中起負性調控作用[15]，并且其上游的調節因子如 AMPK 和 CaMKKα/β 參與Ca2+調控自噬的過程[16]。我們的研究結果表明，與 pH 7.4 正常組相比，pH 6.0 酸化刺激組 CaMKKβ蛋白水平增加，p-AMPK 水平升高，p-mTOR 表達下調，證實 CaMKKβ、AMPK和mTOR可能參與胞外酸化誘導軟骨細胞自噬的過程，同時，酸化刺激組加入BAPTA-AM處理后，CaMKKβ、p-AMPK表達下調，p-mTOR表達上調，表明CaMKKβ、AMPK和mTOR可能作為Ca2+下游信號分子參與調控胞外酸化誘導的大鼠關節軟骨細胞自噬過程。這一研究結果與文獻報道相一致[16]。

綜上所述，本研究證實胞外酸化刺激激活關節軟骨細胞自噬，鈣離子絡合劑BAPTA-AM 可明顯抑制酸化刺激誘導的軟骨細胞自噬，其機制可能與阻斷細胞內 Ca2+水平，調控 CaMKKβ、AMPK 和 mTOR 表達有關。這為研究RA的發病機制提供了新的視角。

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Effects of BAPTA-AM on acid-induced autophagy of rat articular chondrocytes and its possible mechanisms

GAO Wen-fan, CHEN Fei-hu，GE Jin-fang, DENG Zi-yun, LEI Jing, ZHOU Ren-peng, WANG Zhi-sen

(SchoolofPharmacy,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Aim To observe the effect of BAPTA-AM on extracellular acid-induced autophagy in rat articular chondrocytes and its possible mechanisms. Methods Rat articular chondrocytes were isolated from Sprague-Dawley rats and incubated with different pH medium. The states of autophagy were examined by acridine orange (AO) staining .Moreover, the expressions of LC3, Beclin-1, ULK1, CaMKKβ, AMPK and mTOR were detected using Western blot or quantitative real-time PCR(qRT-PCR). Intracellular calcium ([Ca2+]i) was analyzed by a Ca2+-imaging method. Results Compared with pH 6.0 group, BAPTA-AM could significantly decrease the activation of autophagy induced by acid exposure, and the expressions of autophagy markers including LC3Ⅱ, Beclin-1 and ULK1 were also decreased, accompanied with reduced acid-induced [Ca2+]iinflux, decreased proteins expression of CaMKKβ and phosphorylated-AMPK, and increased phosphorylation of mTOR. Conclusion BAPTA-AM can significantly restrain acid-induced autophagy in rat articular chondrocytes, the mechanism of which may be associated with decreased Ca2+influx.

BAPTA-AM; rheumatoid arthritis ;chondrocytes; autophagy; Ca2+；extracellular acidification

時間：2015-4-15 15:44 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150415.1545.014.html

2015-01-29,

2015-03-11

國家自然科學基金資助項目(No 81271949)

高文凡(1991-)，女，碩士生，研究方向：分子藥理學，E-mail:gaowenfan0829@163.com; 陳飛虎(1962-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：抗炎免疫藥理學、分子藥理學,通訊作者，E-mail: cfhchina@sohu.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.05.013

A

1001-1978(2015)05-0655-05

R-332；R322.72；R329.24；R394.2；R977.3