FFJ-5下調PKM2抑制MCF7生長及逆轉MCF7/DOX細胞耐藥性的研究

王天曉，魏曉利，李登云

(河南大學中藥研究所, 河南大學藥學院, 河南 開封 475004)

FFJ-5下調PKM2抑制MCF7生長及逆轉MCF7/DOX細胞耐藥性的研究

王天曉，魏曉利，李登云

(河南大學中藥研究所, 河南大學藥學院, 河南 開封 475004)

目的 探討 FFJ-5 對人乳腺癌細胞 MCF7 及其耐藥細胞 MCF7/DOX 的作用及其機制。方法 采用 MTT 法檢測 FFJ-5 對 MCF7 及 MCF7/DOX 細胞的增殖抑制作用及其對柔紅霉素(doxorubicin, DOX)在耐藥細胞MCF7/DOX中化療敏感性的影響；Western blot 檢測 FFJ-5 對EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、PKM2、caspase-3、cleaved caspase-3、PARP、cleaved PARP及P-gp蛋白表達的影響；DNA ladder 分析檢測FFJ-5對細胞基因組DNA的影響； RT-PCR檢測低劑量 FFJ-5 對多藥耐藥基因MDR1 mRNA 水平的影響。結果 FFJ-5抑制了MCF7 細胞生長，降低了MCF7 細胞中EGFR、Akt 的表達及活性，下調了PKM2 水平；FFJ-5 可激活caspase-3、促使基因組DNA斷裂；同時FFJ-5也能抑制耐藥細胞MCF7/DOX 生長，并增強 DOX 在MCF7/DOX細胞中的活性，同時降低了MCF7/DOX細胞中EGFR、p-EGFR 及PKM2水平，但對MDR1 mRNA水平無影響。 結論 FFJ-5 可通過抑制 EGFR-Akt-PKM2 通路及激活線粒體凋亡相關因子 caspase-3 來抑制MCF7細胞生長，并誘導其凋亡，并可逆轉MCF7/DOX的耐藥性。

FFJ-5；丙酮酸激酶M2；EGFR；Akt；細胞凋亡；細胞耐藥性；信號通路

乳腺癌是女性多發惡性腫瘤之一，手術、放療及化療仍是目前常采用的治療方法，然而，化療耐藥性的產生嚴重阻礙了乳腺癌的有效治療。因此，尋找新的化療藥物及治療靶點或加以輔助手段減少傳統化療藥物的用量并提高其療效具有重要意義。腫瘤細胞與正常細胞代謝上的區別在于即使在供氧充足的條件下，腫瘤細胞的糖酵解產物也很少經過氧化磷酸化過程，腫瘤細胞主要依靠糖酵解的中間產物來合成生物大分子并提供能量，而丙酮酸激酶M2 (pyruvate kinase M2，PKM2) 則觸發了腫瘤細胞有氧酵解的這一代謝過程[1-2]。研究發現，PKM2在多種腫瘤細胞中過表達，還可激活兩個糖酵解基因GLUT1和LDHA，從而促進葡萄糖的消耗以及乳酸的生成，增加了腫瘤的酸性微環境，促進了腫瘤的發生發展，使得腫瘤細胞產生耐藥性，逃避化療藥物[3]。下調PKM2的表達及活性可抑制腫瘤細胞的生長[4]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)過表達與腫瘤細胞的轉移、侵潤、預后差有關，PI3K/Akt通路是EGFR下游的主要信號轉導通路之一。有研究發現，在宮頸癌細胞中抑制Akt的磷酸化可使PKM2水平降低[5]。因此，EGFR/Akt通路可能與PKM2的表達有關。FFJ-5為抗癌中藥茜草提取物的結構修飾物，本研究擬以乳腺癌MCF7及其耐藥細胞MCF7/DOX為實驗對象，研究FFJ-5對EGFR/Akt/PKM2表達的影響，探討FFJ-5的抗腫瘤活性及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑RPMI 1640培養基及新生牛血清購于Invitrogen公司； MTT購于Sigma公司； RT-PCR試劑盒為北京全式金生物公司產品； EGFR(18986-1AP)、p-EGFR(Tyr1068)(1H12)、Akt(11E7)、p-Akt(Ser473)(D9E)、PKM2(D78A4)、caspase-3(8G10)、cleaved caspase-3(Asp175)(5A1E)、PARP(46D11)、cleaved PARP(Asp214)(D64E10)一抗為Cell Sgnaling Technology 公司產品； P-gp(TC3.A.1.201)、β-actin(66009-1-lg)一抗及HRP標記二抗購于Protein Technology；Hoechst 33342及DNA ladder抽提試劑盒為碧云天產品；多柔比星(doxorubicin, DOX)為浙江海正藥業有限公司產品；FFJ-5為茜草提取物的結構修飾物，由河南大學藥學院康文藝老師饋贈。

1.2 細胞培養人乳腺癌細胞MCF7及其耐藥細胞MCF7/DOX購于中國醫學科學院血液學研究所，用含10 %血清、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養基在37℃、5% CO2，飽和濕度條件下培養至對數生長期。MCF7/DOX細胞用終濃度為1.84 μmol·L-1DOX維持其耐藥性，實驗前2周換用無DOX的培養基培養。

1.3 細胞增殖檢測采用MTT方法。FFJ-5的終濃度分別為0、6.75、13.5、27、54、108 μmol·L-1。DOX的使用終濃度分別為0、0.46、0.92、1.84、3.68、7.36 μmol·L-1(在MCF7細胞中)和0、9.2、18.4、36.8、73.6 μmol·L-1(在MCF7/DOX細胞中)。作用48 h后應用酶標儀檢測各孔在490 nm波長下的吸光值(A值)，計算細胞抑制率。

1.4 DNA ladder 分析收集經不同濃度FFJ-5處理48 h 的MCF7 及MCF7/DOX 細胞，用DNA ladder 抽提試劑盒(碧云天產品)提取基因組DNA，然后經1% 瓊脂糖凝膠電泳分析以檢測細胞凋亡。胰酶消化后，PBS或生理鹽水洗1次，1 000～2 000×g離心1～2 min，棄上清，收集細胞。胰酶消化后，PBS或生理鹽水洗1次，1 000～2 000×g離心1～2 min，棄上清，收集細胞。

1.5 Western blot收集經FFJ-5處理48 h后的MCF7及MCF7/DOX細胞，加入RIPA細胞裂解液, 冰上裂解30 min 后, 超聲勻漿提取細胞總蛋白并定量。總蛋白經SDS-PAGE 膠電泳分離后, 轉移至PVDF 膜上, 室溫下5% 脫脂牛奶封閉l h, 加入EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、PKM2、caspase-3、cleaved caspase-3、PARP、cleaved PARP及P-gp一抗4 ℃過夜, 洗膜3 次后, 加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h, 再洗膜3 次, 經化學發光系統(Alpha, USA)檢測蛋白表達水平。β-actin為內參蛋白。

1.6 RT-PCR經0、13.5、27 μmol·L-1FFJ-5處理48 h后的MCF7/DOX細胞，應用TRIzol 試劑提取細胞總RNA，利用RT-PCR試劑盒擴增MDR1 mRNA。MDR1-Forward primer: 5′-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3′, Reverse primer ：5′-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3′ ，Product length:157 bp。GAPDH為內參,Forward primer 5′-CAAGGTCATCCATGACAA CTTTG-3′，Reverse primer 5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′ ，Product length: 496 bp。PCR產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果

2.1 FFJ-5抑制MCF7及MCF7/DOX細胞生長MTT結果顯示，FFJ-5作用48 h后，其對MCF7細胞的IC50為65.79 μmol·L-1，其在MCF7/DOX細胞中的IC50為66.66 μmol·L-1，MCF7及MCF7/DOX細胞的生長受到明顯抑制，并呈劑量依賴性 (Fig 1)。

2.2 FFJ-5抑制MCF7細胞EGFR-Akt-PKM2通路Western blot結果顯示，FFJ-5可劑量依賴性抑制MCF7中PKM2的表達(Fig 2A)。而膜受體酪氨酸激酶(RTKs)-PI3K/Akt- mTOR信號通路在控制細胞的生長、增殖、存活、營養和能量代謝等生命過程中起著重要作用。有研究發現，mTOR通過上調PKM2促進腫瘤細胞有氧糖酵解。因此本研究檢測了FFJ-5對EGFR-Akt-PKM2通路的影響，發現FFJ-5可抑制MCF7細胞中EGFR-Akt的表達和活性(Fig 2B)。可見FFJ-5可能通過抑制EGFR-Akt-PKM2通路來抑制MCF7細胞生長。

2.3 FFJ-5激活caspase-3并引起MCF7細胞基因組DNA斷裂在細胞內凋亡途徑中，誘發線粒體釋放細胞色素C，級聯激活caspase-3，降解底物可促使細胞凋亡。聚ADP核糖多聚酶(PARP)為caspase-3的作用底物，是一種DNA修復相關分子，被酶解失活后細胞的功能和形態發生變化，表現為細胞固縮，與鄰近細胞分離，同時染色質聚集，核碎裂，最后細胞分裂為凋亡小體。本研究顯示，FFJ-5可激活caspase-3，促進PARP裂解(Fig 3A)。DNA ladder 分析結果顯示，FFJ-5可引起MCF7細胞基因組DNA發生斷裂 (Fig 3B)。

Fig 2 Effect of FFJ-5 on expression of EGFR-Akt-PKM2 pathway in MCF7 cells

Western blot was used to detect the levels of PKM2(A), EGFR, p-EGFR, Akt, p-Akt (B) protein. Results showed that FFJ-5 inhibited the pathway of EGFR-Akt-PKM2.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

Fig 3 FFJ-5 activated caspase-3 and induced genomic DNA fragmentation

A: The effect of FFJ-5 on caspase-3 and PARP in MCF7 cells. Western blot was used to detect the levels of caspase-3, cleaved caspase-3, PARP and cleaved PARP. Results showed that FFJ-5 could activate caspase-3 and consequently promote the cleavage of PARP; B: DNA fragmentation analysis. Genomic DNA was extracted from cells exposed to FFJ-5 for 48 h, then DNA ladder analysis was performed. Results showed that FFJ-5 could induce the change of cell apoptotic morphology and DNA fragmentation in MCF7.

2.4 FFJ-5在柔紅霉素耐藥的MCF7/DOX細胞中的作用我們首先對MCF7/DOX的耐藥特征進行鑒定，以阿霉素作為化療藥物，其耐藥倍數為27.90(Fig 4A)，而且MCF7/DOX細胞有多藥耐藥蛋白P-gp的高表達(Fig 4B)，表明MCF7/DOX細胞具有耐藥表型及耐藥特征。由此，我們以MCF7/DOX細胞為實驗對象，研究FFJ-5在耐藥細胞中的作用。我們發現，13.5 μmol·L-1和27 μmol·L-1FFJ-5對MCF7/DOX細胞的生長抑制率小于20%(Fig 4C)，分別以13.5 μmol·L-1和27 μmol·L-1FFJ-5與DOX 合用后，可使DOX在MCF7/DOX細胞中的IC50分別降低21.21%和42.19%，增強了DOX在MCF7/DOX中的敏感性(Fig 4D)。同時我們也檢測了13.5 μmol·L-1和27 μmol·L-1FFJ-5 對MCF7/DOX 細胞中MDR1 mRNA水平的影響，結果顯示,13.5 μmol·L-1和27 μmol·L-1FFJ-5 不會影響MDR1 mRNA的表達(Fig 4E)。但13.5 μmol·L-1和27 μmol·L-1FFJ-5可抑制EGFR的表達及活性，并降低了MCF7/DOX細胞中PKM2的水平(Fig 4F)。上述結果表明，FFJ-5可能不是通過影響MDR1基因表達的方式來增強DOX的敏感性，可能通過其它途徑比如抑制EGFR-PKM2通路來逆轉MCF7/DOX細胞耐藥性。

Fig 4 Roles of FFJ-5 in MCF7/DOX cells

A: IC50of DOX in MCF7 and MCF7/DOX cells; B: The expression of P-gp in MCF7 and MCF7/DOX cells; C: FFJ-5 inhibited the growth of MCF7/DOX cells; D: FFJ-5 increased the activity of DOX in MCF7/DOX cells. All data were expressed as mean±standard deviation (SD); E: The effect of FFJ-5 on MDR1 mRNA in MCF7/DOX. RT-PCR assay was used to detect the mRNA level; F: The effect of FFJ-5 on expression of EGFR and PKM2 in MCF7/DOX cells.

3 討論

中藥茜草為茜草科植物茜草的根及根莖，具有涼血、化瘀、止血之功效。現有研究顯示中藥茜草提取物具有抗腫瘤活性[6-7]。FFJ-5是中藥茜草提取物的結構修飾物，本研究顯示FFJ-5可明顯抑制人乳腺癌MCF7細胞的生長，并可誘導其凋亡。

腫瘤細胞的有氧糖酵解對腫瘤細胞的增殖和凋亡具有重要意義。與線粒體的氧化磷酸化相比，糖酵解可以更加迅速地產生能量，而且糖酵解的許多中間產物可被腫瘤細胞利用合成蛋白質、核酸及脂類，從而滿足腫瘤迅速生長的需要[8-10]。Gatenby和Gillies[11-12]提出，在有氧條件下持續地將葡萄糖向乳酸轉化是腫瘤在形成早期對間歇性缺氧的一種適應性行為，這種轉化使細胞周圍環境酸化，增加了細胞的侵襲性和轉移力，使細胞對放射療法和化學療法產生抵抗效應，從而也促進了腫瘤細胞耐藥性的產生。因此，抑制腫瘤細胞的糖酵解過程則會抑制其生長、促進其凋亡。腫瘤細胞的糖酵解過程受多個酶的調節，這為腫瘤治療提供了很多潛在的靶點。

PKM2作為糖酵解途徑的關鍵酶之一，在腫瘤細胞中高表達，觸發了腫瘤細胞有氧酵解的代謝過程，從而為腫瘤細胞的生長提供物質及能量的需求，促進腫瘤細胞的增殖。PKM2現已成為腫瘤治療的有效靶點，以PKM2為靶點，篩選PKM2抑制劑，對腫瘤治療及抗腫瘤新藥研發具有重要意義。

本研究結果顯示，FFJ-5可下調PKM2表達，而且可能通過抑制EGFR通路來調控PKM2的表達，從而抑制乳腺癌MCF7細胞的生長。也有研究顯示，PKM2與線粒體的細胞凋亡密切相關[13]。本研究顯示，FFJ-5可激活caspase-3，促進PARP裂解，并引起基因組DNA斷裂，從而誘導MCF7 細胞發生凋亡。

本研究也探討了FFJ-5在耐藥細胞MCF7/DOX中的作用，及其對DOX在MCF7/DOX細胞中作用的影響。結果顯示FFJ-5也可抑制耐藥細胞MCF7/DOX的生長，且13.5 μmol·L-1和27 μmol·L-1FFJ-5降低了DOX對MCF7/DOX細胞的IC50，增強了DOX在MCF7/DOX細胞的敏感性。同時對其增強DOX化療敏感性的機制進行初步探討，發現FFJ-5不會影響MCF7/DOX細胞中MDR1 mRNA的表達，其可能通過其它途徑比如EGFR-PKM2通路來增強DOX的敏感性，還有待進一步研究。

綜上，FFJ-5可通過EGFR通路下調PKM2表達，抑制人乳腺癌MCF7細胞生長，并可誘導其凋亡。同時FFJ-5還可增強DOX在耐藥腫瘤細胞中的敏感性，逆轉腫瘤的耐藥性。PKM2可能成為腫瘤治療的有效靶點，FFJ-5有望發展成為一種有效的抗腫瘤候選藥物。

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FFJ-5 inhibits growth of MCF7 cells and reverses drug resistance of MCF7/DOX cells via down-regulation of PKM2

WANG Tian-xiao,WEI Xiao-li,LI Deng-yun

(InstituteofChineseMateriaMedica,HenanUniversity,PharmaceuticalCollegeofHenanUniversity,KaifengHenan475004,China)

Aim To investigate the roles of FFJ-5 in human breast cancer MCF7 cells and drug-resistant MCF7/DOX cells and to explore its mechanisms. Methods MTT assay was used to detect the effect of FFJ-5 on MCF7 and MCF7/DOX cell proliferation and sensitivity of doxorubicin in MCF7/DOX cells. Western blot was used to investigate the effect of FFJ-5 on expression of EGFR, p-EGFR, Akt, p-Akt, PKM2, cleaved caspase-3, cleaved PARP and P-gp. DNA ladder analysis was performed to determine the effect of FFJ-5 on genomic DNA. RT-PCR was performed to detect the influence of FFJ-5 on multidrug resistance gene MDR1 mRNA levels. Results The results showed that FFJ-5 inhibited the growth of MCF7, inhibited the expression and activity of EGFR and Akt, and consequently reduced the expression of PKM2 in MCF7 cells; FFJ-5 activated caspase-3 and induced genomic DNA fragmentation; FFJ-5 also inhibited the growth of MCF7/DOX cells and enhanced the anti-tumor activity of doxorubicin in MCF7/DOX cells. Conclusion The results suggest that FFJ-5 could inhibit MCF7 cell growth and induce MCF7 cell apoptosis through inhibition of EGFR-Akt-PKM2 pathway and activation of apoptosis-related factors caspase-3, meanwhile FFJ-5 could also reverse the resistance of MCF7/DOX.

FFJ-5; PKM2; EGFR; Akt；cell apoptosis；drug resistant cells; cell signal pathway

時間：2015-4-15 15:44 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150415.1545.024.html

2015-01-17,

2015-02-22

河南省科技廳重點攻關項目(No 122102310558)；河南省教育廳自然科學研究項目 (No 2011A310001)

王天曉(1975-)，女，博士，副教授，研究方向：抗腫瘤藥物篩選及機制研究,通訊作者，Tel/Fax：0371-23880680，E-mail：wtx1975@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.05.025

A

1001-1978(2015)05-0721-06

R329.24；R329.25；R345.57；R737.902.2；R979.1