麥冬皂苷B對A549細胞株體外黏附、侵襲及遷移的抑制作用及機制研究

陳美娟，趙若琳，郭園園，寧利敏，張 旭

(南京中醫藥大學，江蘇省中醫藥防治腫瘤協同創新中心，江蘇 南京 210023)

麥冬皂苷B對A549細胞株體外黏附、侵襲及遷移的抑制作用及機制研究

陳美娟，趙若琳，郭園園，寧利敏，張 旭

(南京中醫藥大學，江蘇省中醫藥防治腫瘤協同創新中心，江蘇 南京 210023)

目的 探究麥冬皂苷B (ophiopogonin-B, OP-B)抑制非小細胞肺癌細胞株A549黏附、侵襲、遷移的作用及其機制。方法 細胞黏附實驗、Transwell小室實驗分別檢測細胞黏附、遷移和侵襲能力。通過熒光實時定量反轉錄PCR(qRT-PCR)檢測OP-B對A549細胞中MMP-2/9 mRNA表達水平的調控，Western blot法檢測細胞中MMP-2/9蛋白及其上游調控蛋白Akt及其磷酸化水平的變化。結果 10 μmol·L-1濃度的OP-B能明顯抑制A549細胞黏附、侵襲和遷移，同時能抑制其MMP-2/9 mRNA及蛋白水平的表達，并抑制其上游p-Akt的表達。 結論 OP-B有效抑制A549細胞黏附、侵襲和遷移，其作用與下調MMP-2/9 mRNA和蛋白水平的表達及抑制其上游Akt的磷酸化有關。

麥冬皂苷B; 非小細胞肺癌; 黏附; 侵襲; 遷移; 基質金屬蛋白酶-2; 基質金屬蛋白酶-9

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC) 是肺惡性腫瘤的主要病理類型，也是全世界范圍內癌癥致死的主要原因之一。盡管在 NSCLC 的臨床和實驗腫瘤學方面的研究取得了較大進展，但是其預后仍不理想，目前其5 年生存率僅為11%左右[1]。臨床上將近一半的患者在確診時已進入晚期，并已發生遠處臟器的轉移[2]。

腫瘤細胞的轉移受多因素、多步驟調控，主要包括腫瘤細胞間黏附力降低，與細胞外基質(extracellular matrix, ECM)間黏附力增強，通過降解ECM和基底膜，其遷移、侵襲能力增強，從而易于進入血流或淋巴系統，并最終到達靶器官形成新的腫瘤生長[3]。在此過程中，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是促進侵襲和轉移的關鍵蛋白，尤其是MMP-2和MMP-9的高表達能明顯促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。另外，PI3K/Akt信號轉導通路在MMP-2和MMP-9靶基因表達中發揮關鍵調節作用[4]。

麥冬皂苷B(ophiopogonin-B, OP-B)是從中藥麥冬中分離提取的一種單體，研究表明其對于多種NSCLC細胞株均具有明顯的增殖抑制作用[5]。近年國內外的研究發現，通過抑制PI3K/Akt通路，OP-B能誘導NSCLC、宮頸癌等腫瘤細胞發生自噬[5-6]。但對其在抑制腫瘤細胞侵襲和遷移方面的研究尚未開展。本實驗旨在探究OP-B對肺腺癌細胞株A549的黏附、侵襲和遷移能力的影響及其作用機制，為OP-B抑制NSCLC侵襲轉移提供實驗基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 肺腺癌A549細胞株購自中國科學院上海生命科學院生物化學與細胞生物學研究所。

1.1.2 主要試劑 麥冬皂苷-B購自南京澤朗醫藥科技有限公司 (ZL20110412B)，用二甲亞砜(DMSO)配成10 mmol·L-1濃度的貯液備用，細胞中使用時DMSO的最終濃度小于0.01%。胎牛血清及DMEM/F12培養液購自Gibco公司；胰酶、Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ)、牛血清白蛋白(BSA)、凝膠配置試劑盒購自碧云天生物技術研究所；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購自Millipore公司；Transwell小室購自Corning公司；MMP-2、MMP-9、p-Akt (Ser473)、β-actin一抗及羊抗兔、羊抗鼠二抗均購自Cell Signaling公司；TRIzol購自Invitrogen公司；cDNA第一鏈合成試劑盒購自Fermentas公司；Real time PCR Master Mix (SYBR Green) 購自Toyobo公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將A549細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液中，置37℃、體積分數為5% 的CO2培養箱中培養，實驗時取對數生長期細胞。

1.2.2 細胞黏附實驗 96孔培養板包被：每孔加入CollagenⅠ溶液50 μL，置37℃、5% CO2孵箱中孵育1 h；PBS洗2次，加入3% BSA 0.2 mL，孵育2 h，PBS再洗2次，備用。分別取不同濃度的OP-B(0、5、10 μmol·L-1) 作用細胞24 h，經洗滌、消化后用無血清的DMEM/F12培養基調整細胞濃度為3×108·L-1，分別加入到包被過的96孔板，每孔100 μL，每組設5個平行復孔，37 ℃、5% CO2條件下溫育2 h。棄去各孔培養液，PBS沖洗除去未黏附細胞，每孔加50 μL MTT使用液(PBS溶解，1 g·L-1)，CO2細胞培養箱溫育3 h。吸棄MTT使用液，每孔加DMSO 150 μL，溶解結晶后，酶標儀檢測各孔的 OD570值。黏附抑制率(IR)/%= (1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.3 Transwell小室侵襲實驗 Transwell小室纖維膜孔徑為8 μm，下室中加入600 μL含10%胎牛血清的培養液，上室加入100 μL不含胎牛血清的培養液，然后按照每毫升1×105個細胞的密度在上室加入OP-B(0、5、10、20 μmol·L-1)處理后的細胞懸液30 μL，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養72 h，取出濾膜，甲醇固定，姬姆薩染色，顯微鏡下每張濾膜隨機取5個視野(× 200)拍照，并計數穿膜細胞數，取平均數表示腫瘤細胞的侵襲能力。

1.2.4 RNA提取和qRT-PCR檢測 使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，通過測定OD260/OD280值檢驗其純度和濃度。使用Primer Script反轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq進行qRT-PCR分析，檢測MMP-2、MMP-9的表達水平，結果用磷酸甘油酸脫氫酶 (GAPDH) 的表達量進行標準化。相應的引物序列見Tab 1。使用 DA7600 進行 qRT-PCR 和數據收集。分析qRT-PCR 的結果并計算其相對于臨界循環次數的值，然后轉換為相對 GAPDH 的倍數改變，采用2-△△Ct法進行標準化。

Tab 1 qRT-PCR primer

1.2.5 Western blot 檢測細胞內相關蛋白變化 取對數生長期細胞消化接種到 6 孔板中，細胞密度為 5×108·L-1。藥物處理一定時間后，收集細胞并用 PBS 洗滌 2 次，每孔加入細胞裂解液 200 μL，12 000 r·min-1離心20 min，收集蛋白并定量。取一定量的蛋白，加入 5×電泳上樣緩沖液，沸水浴變性 5 min，經 12% 的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉移至 PVDF 膜，5% 脫脂奶粉封閉后，加入一抗 4℃孵育過夜、二抗室溫孵育 1 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，滴加 ECL發光液置于 BioRad 凝膠成像儀中曝光并采集圖像。

1.2.6 統計學分析 應用SPSS 16.0統計軟件對數據進行統計學處理。計量資料兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析；計數資料組間比較用 Mann-Whitney U 檢驗。

2 結果

2.1 OP-B對A549細胞黏附能力的影響不同濃度的 OP-B (0、5、10 μmol·L-1)分別作用于細胞 24 h后檢測細胞的黏附能力。結果表明，OP-B 作用后，A549細胞的黏附能力逐漸減弱，即藥物對細胞的黏附抑制率逐漸升高，并呈濃度依賴性(Tab 2)，與OP-B (5 μmol·L-1)組的細胞黏附抑制率相比，各組間差異有統計學意義(P<0.01)。

GroupOD570nmTheinhibitionrateofcelladhesion/%Control0.328±0.120OP-B5μmol·L-10.289±0.0111.89OP-B10μmol·L-10.221±0.0432.62**

**P<0.01vsOP-B 5 μmol·L-1group.

2.2 OP-B對A549細胞侵襲遷移能力的影響用帶Matrigel膠的Transwell小室實驗檢測OP-B對A549細胞侵襲能力的影響，結果發現，2.5、5 μmol·L-1的OP-B對A549細胞的侵襲遷移沒有明顯影響，只有在10 μmol·L-1的濃度下處理細胞 24 h 后，才能明顯抑制A549細胞的侵襲和遷移能力(P<0.01)(Fig 1)。

2.3 OP-B對A549細胞中MMP-2和MMP-9基因水平的調控MMPs是一類分解ECM組分的鋅蛋白酶，腫瘤細胞通過已存在或新形成的結合位點與ECM結合，進而溶解ECM，最后經ECM的缺損向外擴散。qRT-PCR進一步研究OP-B對A549細胞中MMP-2/9 mRNA表達水平的調控，發現OP-B對A549細胞中MMP-2 和 MMP-9 mRNA表達水平的抑制呈劑量依賴關系，與Control組相比差異有統計學意義(P<0.01)(Tab 3)。

Fig 1 Effects of OP-B on the invasion and metastasis of A549 cells detected by Matrigel contained transwell chamber assay

The upper figure was the metastasis and invasion cells (SP×200); the lower figure was the analysis compared with control group.A: Control group; B～D: 2.5, 5, 10μmol·L-1OP-B treated group.**P<0.01vscontrol group

GroupMMP-2(2-ΔΔCT)MMP-9(2-ΔΔCT)Control1.000±0.0111.000±0.024OP-B5μmol·L-10.408±0.037**0.618±0.006**OP-B10μmol·L-10.121±0.004**0.107±0.001**

**P<0.01vscontrol group.

2.4 OP-B對A549細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平的影響前面的結果顯示10 μmol·L-1濃度的OP-B能明顯抑制A549細胞的黏附和侵襲、遷移，為進一步探究OP-B抑制A549細胞黏附、侵襲和遷移的作用機制，進一步用Western blot法檢測了MMP-2和MMP-9蛋白的表達。結果表明，與其抑制A549細胞中MMP-2 和MMP-9 mRNA水平的表達相一致，OP-B對MMP-2和MMP-9蛋白的表達抑制呈時間依賴性，同時，對調控遷移的上游蛋白Akt的磷酸化具有明顯的抑制作用(Fig 2)。

Fig 2 Effects of OP-B on the expression of p-Akt,Akt, MMP-2 and MMP-9 in A549 cells

3 討論

腫瘤治療失敗的原因主要是復發和發生重要器官的轉移。即使同為Ⅰ期的腫瘤患者，NSCLC患者的術后轉移復發風險高于其他腫瘤患者，且預后也明顯差于其他腫瘤患者[7]。

臨床上，中藥在穩定瘤體，防止腫瘤的遷移和復發上普遍具有一定的優勢，“周氏克金巖方”在肺癌的臨床治療中同樣表現出相關的抑制NSCLC細胞遷移的作用。前期研究發現，麥冬皂苷B是“周氏克金巖方”中代表性的抗癌成分，其對多種NSCLC細胞株均具有明顯的增殖抑制作用，并能有效誘導肺鱗癌細胞株 NCI-H157及巨細胞癌細胞株 NCI-H460發生二型程序性死亡[5]，但其對肺癌細胞黏附、侵襲及遷移的影響有待研究。

本研究首先通過細胞黏附實驗初步發現，OP-B能明顯降低A549細胞的黏附能力，并呈濃度依賴性(Tab 2)。腫瘤細胞侵襲/遷移能力的研究方法主要有細胞劃痕實驗及Transwell 小室實驗[8]，本研究選擇了含Matrigel膠的Transwell小室實驗進行藥物對A549細胞侵襲、遷移能力影響的觀察，結果表明，OP-B在10 μmol·L-1濃度下能有效抑制A549細胞的遷移和侵襲(Fig 1)。

另外，腫瘤轉移是一個復雜、多步驟的過程，腫瘤細胞脫離原發灶后，通過降解基底膜，向外浸潤、遷移并黏附于血管內皮細胞，然后進入循環系統并停留于遠處的血管壁，最終穿過血管侵入ECM形成轉移灶[9]。其中，ECM的降解是腫瘤浸潤正常組織及開始轉移的基本途徑。研究表明，在這一過程中MMPs發揮了重要的作用，尤其是MMPs家族成員明膠酶 (MMP-2和MMP-9)，由于其能夠特異性降解基底膜的主要成分Ⅳ型膠原和ECM，在多種惡性腫瘤的侵襲轉移過程中發揮至關重要的作用[10]。

qRT-PCR 和Western blot研究發現，OP-B作用于A549細胞后，不僅降低細胞中MMP-9 和 MMP-2 mRNA水平的表達，而且下調細胞中MMP-2和MMP-9蛋白水平的表達，并呈時間依賴性(Fig 2和Tab 3)。因此，OP-B抑制NSCLC細胞黏附、侵襲和遷移與抑制MMP-2和MMP-9的表達有關。

此外，Akt可以通過激活MMP-9和MMP-2促進腫瘤的侵襲和遷移[11-12]。因此，抑制Akt的表達被作為抑制腫瘤轉移的調控靶點，并且研究發現Akt的激活即形成磷酸化的Akt(p-Akt)與NSCLC的轉移密切相關，p-Akt的過表達可以提高NSCLC黏附、侵襲和轉移能力[13]。本研究表明，OP-B同時能抑制A549細胞中p-Akt的表達(Fig 3)

綜上，本實驗結果首次證明了OP-B抑制NSCLC細胞A549的黏附、侵襲和遷移，其作用與下調MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表達及抑制其上游p-Akt的水平有關。由此表明，OP-B具有較好的抗NSCLC轉移作用，為OP-B的進一步藥物研發和臨床應用提供了實驗基礎和依據。

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Inhibitory effect of ophiopogonin-B on adhesion,invasion and migration of A549 cellsinvitro

CHEN Mei-juan, ZHAO Ruo-lin, GUO Yuan-yuan, NING Li-min, ZHANG Xu

(NanjingUniversityofChineseMedicine，JiangsuCollaborativeInnovationCenterofTraditionalChineseMedicinePreventionandTreatmentofTumor,Nanjing210023,China)

Aim To explore the inhibitory effects of ophiopogonin-B (OP-B) on cell adhesion, invasion and migration in non-small cell lung cancer (NSCLC) A549 cellsinvitroand its possible mechanism. Methods Cell adhesion assay and transwell chamber assay were used to detect the ability of cell adhesion, migration and invasion. qRT-PCR was used to detect the mRNA levels of MMP-2 and 9. Meanwhile, Western blot assay was performed to determine the protein levels of MMP-2/9 and p-Akt. Results OP-B significantly inhibited the ability of cell adhesion, invasion and migration in A549 cells at the concentration of 10 μmol·L-1(P<0.01). Meanwhile, it inhibited the mRNA and protein levels of MMP-2 and MMP-9 and down-regulated the phosphorylation of Akt (P<0.01). Conclusion OP-B inhibits cell adhesion, invasion and migration in A549 cells through down-regulation of the mRNA and protein expression of MMP-2/ 9, and the inhibitory effect on the expression of p-Akt.

ophiopogonin-B; non-small cell lung cancer; adhesion; invasion; migration; matrix metalloproteinase-2; matrix metalloproteinase-9

時間：2015-4-15 15:44 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150415.1545.015.html

2015-01-08,

2015-01-29

江蘇省自然科學基金資助項目(No BK20131415)；江蘇省高校優勢學科建設工程項目(PAPD)；歐盟第七框架項目(No PIRSES-GA-2013-612589)

陳美娟(1977-)，女，博士，副教授，研究方向：中醫藥抗腫瘤作用及機制研究， E-mail：mjchen9680@sina.com； 張 旭(1968-)，女，博士，教授，研究方向：中醫藥抗腫瘤作用及機制研究，通訊作者，E-mail：zhangxu@njutcm.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.05.014

A

1001-1978(2015)05-0660-05

R282.71；R284.1；R329.25；R734.202.2；R977.3