抑制自噬促進培美曲塞對A549細胞的增殖抑制作用

趙大海,陸友金

(安徽醫科大學第二附屬醫院呼吸內科,安徽 合肥 230601)

抑制自噬促進培美曲塞對A549細胞的增殖抑制作用

趙大海,陸友金

(安徽醫科大學第二附屬醫院呼吸內科,安徽 合肥 230601)

目的 研究培美曲塞對肺癌細胞A549自噬的作用及自噬的功能。方法 采用MTS法觀察培美曲塞對A549細胞的增殖抑制作用；采用透射電鏡和免疫印跡觀察培美曲塞對A549細胞自噬體和自噬相關蛋白的影響；采用自噬抑制劑CQ抑制自噬后觀察培美曲塞對A549細胞的抑制作用。結果 培美曲塞抑制A549細胞的增殖；培美曲塞誘導A549細胞自噬體表達增加，并誘導自噬相關蛋白Beclin-1表達和LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉換增加，p62表達降低；自噬抑制劑CQ提高培美曲塞對A549細胞抑制作用，使培美曲塞單藥組的抑制率由(28.42±2.45)%增加到CQ聯合培美曲塞組的(45.36±3.52)%。結論 培美曲塞可以誘導肺癌細胞A549自噬增加，抑制自噬提高培美曲塞對A549細胞的增殖抑制作用，為肺癌的臨床治療提供新的聯合治療方案。

自噬；培美曲塞；肺癌；LC3; p62；氯喹

自噬是細胞在饑餓、能量缺乏等代謝壓力下的一種生理過程。細胞內的蛋白質、細胞器和胞質通過自噬作用被包裹、消化，最終降解成核苷、氨基酸和脂肪酸循環利用，合成新的大分子和ATP，以維持細胞的正常代謝和生存[1]。自噬異常與腫瘤等疾病密切相關[2]。研究表明，抗腫瘤藥物可以不同程度引起腫瘤細胞自噬，抑制自噬可以提高抗腫瘤藥物對腫瘤細胞的增殖抑制作用，使腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性增加[3]。目前正在開展多項臨床研究以評價自噬抑制劑聯合分子靶向治療藥物或化療藥物對實體瘤的療效(www.clinicaltrials.gov)。培美曲塞二鈉(pemetrexed disodium, PEM) 是一種新型多靶點抗代謝類藥物，主要通過抑制胸苷酸合成酶、二氫葉酸還原酶和甘氨酰胺核苷甲酰基轉移酶，干擾復制過程中葉酸的代謝而發揮抗腫瘤作用[4]。培美曲塞聯合鉑類是肺腺癌患者的標準治療[4]。但是同所有抗腫瘤藥物類似，天然或獲得性耐藥是其療效不佳的重要原因。培美曲塞在肺癌治療過程中療效不佳的原因是否與誘導自噬相關尚不清楚。本實驗通過體外研究觀察培美曲塞對肺腺癌細胞株A549自噬的作用，并在此基礎上探討自噬的功能，為臨床更加合理化的治療方案提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑人A549肺癌細胞購自中科院上海細胞庫；DMEM高糖培養基、胎牛血清購于Gibco公司;預染蛋白分子量Marker購自Fermentas公司；PVDF 膜購于Millipore公司；培美曲塞購于美國禮來公司；氯喹(chloroquine, CQ)購于Sigma Aldrich公司；LC3、Beclin-1、p62、GAPDH和HRP標記的羊抗兔IgG抗體購于Cell Signaling Technology。

1.2 方法

1.2.1 細胞增殖抑制實驗 采用MTS法檢測細胞增殖。取對數期細胞，接種于96孔培養板內，每孔1×104個細胞，24 h后將培養液換成含藥物的新鮮培養液。分別培養24、48、72 h后，加入10 μL MTS試劑，37℃ 孵育0～4 h，每隔30 min用酶標儀在490 nm波長下測量吸光值 (A490 nm)。空白組只含有培養基而無細胞，按下式計算藥物對腫瘤細胞生長的抑制率：腫瘤細胞生長抑制率(inhibitory rate, IR)/%=(1-實驗組A值/細胞組A值)×100%。通過Graph Pad Prism 3.0 軟件繪制細胞增殖活性曲線，并算出半數抑制濃度(IC50)值。

1.2.2 透射電鏡觀察自噬體 取對數生長期細胞每孔1×105個接種于6孔板上培養過夜，加入指定濃度培美曲塞孵育24 h后，細胞收集在離心管內，PBS沖洗后，用2.5%的戊二醛、1%的鋨酸雙固定，梯度乙醇脫水、滲透、包埋、聚合、超薄切片，染色，拍照。

1.2.3 免疫印跡分析 將A549細胞接種于6孔板中，24 h后加入相應的藥物和新鮮培養液，處理所需時間后，用冷PBS清洗，再用RIPA裂解液裂解細胞，離心后收集上清，取等量蛋白上樣液進行SDS PAGE電泳。電泳結束后，將分離的蛋白轉移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，之后加入一抗于4℃ 搖床孵育過夜，TBST洗膜加入相應的HRP標記的羊抗兔IgG,37℃孵育2 h, 最后用Biological Industries ECL發光試劑盒顯影。富士化學發光成像儀Las-4000成像,觀察各條帶深淺變化并加以分析,GAPDH作為對照。

2 結果

2.1 培美曲塞對A549肺癌細胞的增殖抑制作用培美曲塞在0～9.6 μmol·L-1濃度范圍內對A549細胞株有增殖抑制作用，抑制率隨著藥物濃度的升高和時間的延長而增加，呈劑量和時間依賴性(Fig 1)。培美曲塞0、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6 μmol·L-1濃度時作用于A549 72 h后的抑制率依次為：(0.56±0.12)%、(8.24±0.98)%、(28.42±2.45)%、(39.56±3.21)%、(65.79±4.63)%。IC50為(6.43±2.57) μmol·L-1。

2.2 培美曲塞誘導肺癌細胞自噬

2.2.1 培美曲塞誘導自噬體增加 自噬在形態學上典型的表現是含有雙層膜的自噬體。有無雙層膜的自噬體是判斷自噬存在與否的金標準。為了觀察培美曲塞處理后A549細胞自噬體的變化，我們采用 1.2 μmol·L-1培美曲塞處理A549細胞24 h后，收集細胞采用透射電鏡觀察自噬體的變化。透射電鏡發現藥物處理組含有雙層膜的自噬體明顯增多，而對照組只能觀察到少數自噬囊泡形成(Fig 2)。這表明培美曲塞誘導自噬體增多。

Fig 1 Inhibitory effect of pemetrexed (PEM) on proliferation of A549 cells

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 2 Autophagosome increases in PEM treated A549 cells

A: Numerous typical double-layer membrane autophagosomes (arrows) appeared in A549 cells treated with 1.2 μmol·L-1PEM for 24 h. (a:control, b: PEM treatment); B: The number of autophagosomes was calculated by continuous counts in 30 fields under high resolution. Bar = 1 μm.**P<0.01vscontrol

2.2.2 培美曲塞誘導自噬相關蛋白表達 自噬相關蛋白ATG8在哺乳動物的類似物為微管相關蛋白輕鏈3 (light chain 3，LC3)。LC3在其C末端被ATG4剪切，形成LC3-Ⅰ。LC3-Ⅰ通過ATG7和ATG3同磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)相偶聯，形成LC3-Ⅱ,定位于自噬體的內外層膜。LC3參與了前體膜的延長和閉合，也參與了自噬體的形成。因此，ATG8/LC3是自噬的重要分子標記物。p62是一種同LC3相互作用的蛋白，p62的表達同自噬活化呈負相關。Western blot分析表明，隨著培美曲塞濃度的增加，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉換增加。Beclin-1蛋白隨著藥物濃度的增加表達增加。相反，p62表達隨著培美曲塞濃度的增加而降低(Fig 3)。這表明培美曲塞誘導自噬活化增加。

Fig 3 Autophagy related proteins are induced by exposure to PEM

Cells were incubated with the indicated concentration of PEM for 24 h. The transition of LC3-Ⅰ to LC3-Ⅱ and Beclin-1 were increased and the expression of p62 was decreased.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.3 抑制自噬提高培美曲塞對肺癌細胞的增殖抑制作用自噬在腫瘤的發生發展中起著重要的作用。在本研究中我們觀察到培美曲塞誘導肺癌細胞自噬活化增加，但并不清楚自噬活化促進培美曲塞的抗腫瘤作用或導致腫瘤細胞耐藥的發生。氯喹(chloroquine, CQ)是特異性自噬抑制劑，主要抑制了自噬體和溶酶體的結合，抑制自噬的降解，使得自噬體在細胞內增加。Western blot分析表明，自噬抑制劑CQ聯合PEM組，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉換增加更為明顯。MTS分析表明，自噬抑制劑CQ促進了培美曲塞對肺癌細胞A549的抑制作用。1.2μmol·L-1培美曲塞對A549細胞的抑制率為(28.42±2.45)%，CQ聯合培美曲塞對A549細胞的抑制率為 (45.36±3.52)% ,見Fig 4。

Fig 4 Inhibition of autophagy facilitates the inhibitory effect of PEM on A549 cells

A:Western blot for the transition of LC3-I to LC3-Ⅱ in A549 cells treated with 1.2 μmol·L-1PEM in the presence or absence of 5 μmol·L-1CQ; B:A549 cells were treated with 1.2 μmol·L-1PEM or DMSO in the presence or absence of CQ (5 μmol·L-1) for 72 h. Inhibitory rate was measured by MTS assay.*P<0.05,**P<0.01vsPEM treated alone.

3 討論

非小細胞肺癌是我國發病率和死亡率位于第1位的惡性腫瘤[5]。鉑類為基礎的兩藥聯合化療方案是目前晚期EGFR狀態未知肺非鱗癌患者的標準治療方案。Ⅲ期臨床研究表明培美曲塞聯合鉑類化療方案能改善患者的總生存時間(over survival, OS)[6]。本研究表明，培美曲塞對A549表現出不同的抗腫瘤作用。培美曲塞對腫瘤細胞的抑制作用具有劑量和時間依賴性。

自噬是廣泛存在于從酵母、線蟲、果蠅到高等脊椎動物的細胞中一種自我保護的過程[1]。饑餓、能量缺乏等代謝應激可誘導自噬活化[7]。大量的研究表明，抗腫瘤藥物如奧沙利鉑、氟尿嘧啶等可以不同程度地誘導自噬發生[8-9]。陳美娟等[10]通過對自噬效應在非小細胞肺癌靶向治療中的應用進行綜述分析認為，在非小細胞肺癌治療的過程中，要充分考慮到自噬的作用，對其進行合理的調節。本研究中，我們發現培美曲塞處理肺癌細胞后透射電鏡可以觀察到自噬體的增加。此外，蛋白印跡實驗表明培美曲塞可以誘導自噬相關蛋白Beclin-1表達增加，p62表達減少，同時促進了LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉換。這些結果表明培美曲塞誘導A549細胞自噬活化。

自噬是一種高度動態的過程，在腫瘤的發生發展過程中有兩面性。一方面，過度活化的自噬導致細胞死亡的發生，即“自噬性細胞死亡”[11]；另一方面，自噬通過降解細胞內大分子成份為自身提供能量從而促進細胞生長，導致腫瘤耐藥的發生及加速腫瘤細胞的增殖。在本研究中，我們觀察到培美曲塞誘導自噬活化增加，但是我們并不清楚自噬活化在這一過程中是導致細胞對培美曲塞耐藥增加，還是導致自噬性死亡。我們發現自噬抑制劑CQ處理后LC3-Ⅱ表達增加。培美曲塞組聯合CQ組LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉換增加更為明顯。MTS實驗表明自噬抑制劑CQ提高了培美曲塞對肺癌細胞的增殖抑制作用，使得培美曲塞對肺癌細胞的抑制率由單藥時的28%左右增加到聯合組的45%左右。這表明自噬活化導致A549肺癌細胞對培美曲塞的敏感性降低，抑制自噬使得培美曲塞對肺癌細胞的抑制作用增加。這與現有的研究相一致，大多數研究認為自噬使得腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的耐藥性增加，抑制自噬可以提高腫瘤細胞對抗腫瘤治療的敏感性，增加對腫瘤細胞的增殖抑制作用。

總之，培美曲塞可以誘導肺癌細胞自噬發生。自噬活化使得肺癌細胞對培美曲塞的敏感性降低，抑制自噬可以提高培美曲塞對肺癌細胞的抑制作用。培美曲塞誘導自噬的分子機制及抑制自噬提高培美曲塞抗腫瘤作用是否與促進凋亡相關尚需進一步研究。

(致謝：感謝安徽醫科大學第一附屬醫院老年呼吸內科劉榮玉教授的關心和指導，感謝中國科技大學生命科學院周江寧老師及實驗室的各位同仁的幫助與支持。)

[1] Rosenfeldt M T， Ryan K M. The multiple roles of autophagy in cancer[J].Carcinogenesis, 2011, 32(7): 955-63.

[2] Won K Y, Kim G Y, Kim Y W, et al.Clinicopathologic correlation of beclin-1 and bcl-2 expression in human breast cancer[J].HumPathol, 2010, 41(1): 107-12.

[3] Sui X, Chen R, Wang Z, et al. Autophagy and chemotherapy resistance: a promising therapeutic target for cancer treatment[J].CellDeathDis, 2013, 4: e838.

[4] Gentzler R D, Patel J D. Optimal first-line and maintenance treatments for advanced-stage nonsquamous non-small cell lung cancer[J].JNatlComprCancNetw, 2014,12(6):889-97.

[5] Jemal A, Bray F, Center M M, et al. Global cancer statistics[J].CACancerJClin, 2011, 61(2): 69-90.

[6] Scagliotti G V. Pemetrexed: a new cytotoxic agent in the development for first-line non-small-cell lung cancer[J].LungCancer, 2005, 50(Suppl 1): S18-9.

[7] Clarke R, Cook K L, Hu R, et al. Endoplasmic reticulum stress, the unfolded protein response, autophagy, and the integrated regulation of breast cancer cell fate[J].CancerRes,2012, 72(6): 1321-31.

[8] Selvakumaran M, Amaravadi R K, Vasilevskaya I A, et al. Autophagy inhibition sensitizes colon cancer cells to antiangiogenic and cytotoxic therapy[J].ClinCancerRes, 2013, 19(11): 2995-3007.

[9] Guo X L, Hu F, Zhang S S, et al. Inhibition of p53 increases chemosensitivity to 5-FU in nutrient-deprived hepatocarcinoma cells by suppressing autophagy[J].CancerLett, 2014, 346(2): 278-84.

[10] 陳美娟,詹 諂,張 旭. 腫瘤自噬效應及其在非小細胞肺癌分子靶向治療中的潛在應用[J]. 中國藥理學通報, 2012, 28(3):300-3.

[10] Chen M J, Zhan Z, Zhang X. Autophagic effect on tumor and its potential applications in non-small cell lung cancer molecular trargetd therapy[J].ChinPharmacolBull, 2012, 28(3):300-3.

[11]Degenhardt K, Mathew R, Beaudoin B, et al. Autophagy promotes tumor cell survival and restricts necrosis, inflammation, and tumorigenesis[J].CancerCell, 2006, 10(1): 51-64.

Autophagy inhibition facilitates the anti-proliferative effect of pemetrexed on A549 cells

ZHAO Da-hai, LU You-jin

(DeptofRespiratoryMedicine,theSecondHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230601,China)

Aim To explore the effect of pemetrexed on autophagy and the function of autohpagy activation in A549 cells. Methods The anti-proliferative effect of pemetrexed on A549 cells was detected by MTS. The formation of autophagosome was observed by transmission electron microscopy (TEM) and the expression of autophagy-related proteins was determined by Western blot. The inhibitory effects of the combination of pemetrexed and a selective autophagy inhibitor on A549 cells were measured by MTS. Results Pemetrexed inhibited the proliferation of A549 cells. Autophagy was activated in A549 cells by exposure to pemtrexed. Autophagosome was increased in pemetrexed treatment cells compared with control group. Pemtrexed treatment led to the formation of autophagosome and the conversion of LC3-Ⅰ to LC3-Ⅱ. The increase of Beclin-1 and the decline of autophagy substrate of p62 were observed in pemtrexed treated A549 cells. The pharmacological autophagy inhibitor chloroquine (CQ) sensitized A549 cells to pemetrexed treatment. The inhibitory rate was (28.42±2.45)% for pemetrexed only, and (45.36±3.52)% for pemetrexed combined with CQ. Conclusions Pemetrexed could activate autophagy in A549 cell lines. The disruption of autophagy facilitates the anti-proliferative effect of pemetrexed on A549 cells, which provides a novel strategy in lung cancer treatment.

autophagy; pemetrexed; lung cancer; LC3; p62；chloroquine

時間：2015-4-15 15:44 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150415.1545.012.html

2014-12-21,

2015-01-28

安徽省高校省級自然科學研究項目(No KJ2013A145)

趙大海(1973-),男,博士生,副主任醫師,研究方向：肺癌的治療，E-mail:879766645@qq.com; 陸友金(1962-),男,碩士，主任醫師,副教授,碩士生導師,研究方向：肺癌的治療，通訊作者，E-mail: luyougolden@hotmail.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.05.015

A

1001-1978(2015)05-0664-05

R329.24；R329.25；R734.2；R979.1