二氟甲基鳥氨酸對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大與凋亡的影響

林 巖，肖 薇，李 波，金 莉，王國(guó)忠，王 珺，趙雅君，徐長(zhǎng)慶，劉吉成

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 1.醫(yī)藥研究所、2.病理生理教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室， 黑龍江 哈爾濱 150086；4.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合博士后流動(dòng)站，黑龍江 哈爾濱 150040)

二氟甲基鳥氨酸對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大與凋亡的影響

林 巖1，2，4，肖 薇2，李 波2，金 莉2，王國(guó)忠2，王 珺2，趙雅君3，徐長(zhǎng)慶3，劉吉成1

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 1.醫(yī)藥研究所、2.病理生理教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室， 黑龍江 哈爾濱 150086；4.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合博士后流動(dòng)站，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的 探討二氟甲基鳥氨酸(difluoromethylornithine，DFMO)對(duì)異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大和凋亡的影響。方法 實(shí)驗(yàn)分為4組：Control組、ISO組、ISO+ DFMO組和ISO+DFMO+Pu 組。利用ISO建立心肌細(xì)胞肥大模型，0.5 mmol·L-1DFMO和0.5 mmol·L-1腐胺預(yù)處理后檢測(cè)ANP基因表達(dá)和心肌細(xì)胞表面積；檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性和MDA含量，Annexin V/PI法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率，real time-PCR和Western blot檢測(cè)Bcl-2和Bax基因及蛋白表達(dá)。結(jié)果 與ISO組相比，DFMO預(yù)處理后心肌細(xì)胞表面積和ANP基因表達(dá)降低(P<0.05)，培養(yǎng)液中LDH和MDA釋放量均下降 (P<0.05)，心肌細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)；同時(shí)，DFMO上調(diào)Bcl-2基因和蛋白水平(P<0.05)，上調(diào)Bcl-2/Bax比值 (P<0.05)，下調(diào)Bax基因和蛋白水平(P<0.05)。結(jié)論 DFMO對(duì)ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大和凋亡有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與Bcl-2和Bax 表達(dá)有關(guān)。

多胺；二氟甲基鳥氨酸；心肌肥大；細(xì)胞凋亡；Bcl-2；Bax

多胺是包括腐胺、精脒和精胺在內(nèi)的一類小分子脂肪族化合物，在生物體的各種組織細(xì)胞內(nèi)廣泛存在，其作為體內(nèi)的代謝調(diào)控物質(zhì)，在細(xì)胞增殖分化中發(fā)揮重要作用[1]。近年研究表明，多胺在細(xì)胞凋亡過(guò)程中也扮演著重要角色[2]。鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase，ODC)是多胺合成途徑中的關(guān)鍵限速酶。二氟甲基鳥氨酸(difluoromethylornithine，DFMO)已成為公認(rèn)的最有效的ODC特異性抑制劑，它同鳥氨酸的結(jié)構(gòu)類似，可作為ODC的底物進(jìn)行脫羧反應(yīng)，導(dǎo)致ODC發(fā)生不可逆的結(jié)構(gòu)改變，明顯抑制多胺含量[3]。

我們前期研究表明[4-5]，異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO) 誘導(dǎo)心肌肥大的同時(shí)上調(diào)ODC蛋白表達(dá)水平，多胺含量增加，從而激活ODC/多胺通路，本研究將進(jìn)一步探討ODC特異性抑制劑DFMO 對(duì)病理性心肌肥大細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，為其在心肌肥厚的臨床防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物新生2～5 d SD大鼠乳鼠共30只，雌雄不拘，由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物研究所提供。

1.2 藥品與試劑TRIzol試劑和real-time PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于日本TaKaRa公司；ISO、DFMO、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DEME培養(yǎng)基、新生牛血清購(gòu)自Gibco；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH )試劑盒、丙二醛(malonic dialdehyde, MDA )測(cè)試盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)公司；β-actin 抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz生物公司；Bcl-2、Bax一抗和辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)山羊抗兔和兔抗鼠二抗購(gòu)自武漢博士德生物科技有限公司。

2 方法

2.1 乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)取新生乳鼠，無(wú)菌條件下開胸取心，D-Hanks液洗去殘血，剪成1 mm3大小碎片，加入0.25%胰蛋白酶，分次消化制成單細(xì)胞懸液后，正常培養(yǎng)液于37℃、5% CO2飽和濕度條件下差速貼壁1 h后，調(diào)整細(xì)胞濃度接種到培養(yǎng)板上，置入37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁24 h后出現(xiàn)自發(fā)性同步搏動(dòng)，于接種48 h 后換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組培養(yǎng)4 d的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為4組：① Control組：無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液； ② ISO組：加入ISO，終濃度為1 μmol·L-1，作用48 h；③ ISO+DFMO 組：細(xì)胞在加入ISO前24 h加入0.5 mmol·L-1DFMO；④ ISO+DFMO+Pu 組：細(xì)胞在加入ISO前24 h加入DFMO和腐胺(putrescine, Pu), 終濃度分別為0.5 mmol·L-1。

2.3 心肌細(xì)胞表面積測(cè)定將細(xì)胞以1×105·L-1密度接種于6 孔板中，24 h后爬片，藥物干預(yù)后95% 乙醇固定15 min，行HE染色。采用Leica2Q500 圖像分析系統(tǒng)測(cè)定心肌細(xì)胞表面積，隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野測(cè)定5個(gè)細(xì)胞，取其平均值。

2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)按照TRIzol試劑說(shuō)明書提取心肌細(xì)胞總RNA。參照TaKaRa 公司提供的real time-PCR 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成特異性引物用于定量檢測(cè)ANP、Bcl-2和Bax 基因的表達(dá)。ANP上游引物：5’- GGGAAGTCAACCCGTCTCA -3′，下游引物：5’- GGGCTCCAATCCTGTCAAT -3′；Bcl-2上游引物：5′-TGAACCGGCATCTGCACAC-3′，下游引物：5′-CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG-3′； Bax上游引物：5′-AGACACCTGAGCTGACCTTGGAG-3′，下游引物5′-GTTGAAGTTGCCATCAGCAAACA-3′。同時(shí)采用β-actin為內(nèi)參，mRNA的表達(dá)倍數(shù)改變采用2ΔCt表示。

2.5 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)取各組心肌細(xì)胞，加裂解液，離心后吸取上清液，Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。各組取30 μg上樣，SDS-PAGE 電泳，蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉液室溫封閉1 h后分別加入一抗Bcl-2、Bax多克隆抗體和 β-actin 單克隆抗體，濃度均為1 ∶500，4℃孵育過(guò)夜，相應(yīng)二抗孵育1.5 h，濃度1 ∶5 000。化學(xué)發(fā)光ECL顯色。電泳成像系統(tǒng)定量掃描分析，結(jié)果以 β-actin 校正。

2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率采用 Annexin V/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，PBS清洗后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙錠(PI)至細(xì)胞懸液中，輕輕搖勻，置冰浴中反應(yīng)10 min，加入400 μL預(yù)冷binding buffer至樣品中，1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)(激發(fā)光488 nm，發(fā)射光578 nm)，各組陽(yáng)性細(xì)胞百分率表示細(xì)胞凋亡率。

2.7 細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH 和MDA含量檢測(cè)分別按各自檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書步驟，取各組培養(yǎng)液上清，測(cè)定LDH和MDA釋放量。

3 結(jié)果

3.1 DFMO抑制ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大由Tab 1顯示，與Control相比，ISO作用48 h后心肌細(xì)胞表面積明顯增加 (P<0.01)，ANP 基因表達(dá)增高(P<0.05)；DFMO預(yù)處理后明顯抑制心肌細(xì)胞表面積(P<0.01)，同時(shí)ANP基因表達(dá)降低(P<0.01)。與ISO+DFMO 組比較，ISO+DFMO+Pu組心肌細(xì)胞ANP 基因表達(dá)增加(P<0.05)，細(xì)胞表面積略有增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

GroupCellsurfacearea/μm2·cell-1ANP/β-actinControl3904.4±218.31.00±0.2ISO4730.2±202.5**1.48±0.3*ISO+DFMO4043.6±246.7##1.16±0.2##ISO+DFMO+Pu4692.6±235.91.41±0.2▲

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsISO group;▲P<0.05vsISO+DFMO group

3.2 DFMO減少細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性和MDA含量Tab 2結(jié)果可見，ISO作用心肌細(xì)胞后 LDH 和 MDA 釋放量均明顯增加 (P<0.01)，表明ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的同時(shí)伴有細(xì)胞損傷。與ISO組相比，DFMO預(yù)處理后，LDH 和 MDA 釋放量均降低(P<0.05)，表明心肌細(xì)胞損傷有所減輕，補(bǔ)充外源性腐胺后，LDH 和 MDA 釋放量增加 (P<0.05)。

3.3 DFMO抑制心肌細(xì)胞凋亡Annexin V/PI 凋亡檢測(cè)結(jié)果表明(Tab 2)，ISO組與Control組比較，心肌細(xì)胞凋亡率增加 (P<0.05)。 DFMO干預(yù)后，心肌細(xì)胞凋亡率下降 (P<0.05)， 補(bǔ)充外源性腐胺后，心肌細(xì)胞凋亡率增加 (P<0.05) 。

Tab 2 Effect of DFMO on the contents of LDH and MDA in

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsISO group;▲P<0.05vsISO+DFMO group

3.4 DFMO對(duì)心肌細(xì)胞Bcl-2和Bax基因表達(dá)的影響實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示(Fig 1)，ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大后Bcl-2基因表達(dá)下降(P<0.05)， Bax基因表達(dá)增加(P<0.05)。DFMO預(yù)處理后，Bcl-2基因表達(dá)上調(diào)，Bax基因表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。與ISO+DFMO組比較，ISO+DFMO+Pu組逆轉(zhuǎn)了Bcl-2和Bax基因表達(dá)(P<0.05)。

3.5 DFMO對(duì)心肌細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響Western blot 結(jié)果表明(Fig 2、3)，ISO作用心肌細(xì)胞可下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)(P<0.05)，增加Bax 蛋白表達(dá)(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值明顯下降(P<0.01)。DFMO預(yù)處理后，Bcl-2 蛋白水平上調(diào)，Bax 蛋白水平下調(diào)(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值明顯增加(P<0.01)。 補(bǔ)充外源性腐胺后，Bcl-2蛋白水平下調(diào)，同時(shí)Bax 蛋白水平上調(diào)(P<0.05)。Bcl-2/Bax比值降低明顯(P<0.01)。

Fig 1 Effect of DFMO on the gene expression of Bcl-2

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsISO group;▲P<0.05vsISO+DFMO group

Fig 2 Effect of DFMO on the protein expression of Bcl-2

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsISO group;▲P<0.05vsISO+DFMO group

Fig 3 Effect of DFMO on Bcl-2/Bax ratio of

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsISO group;▲▲P<0.01vsISO+DFMO group

4 討論

心肌肥大是心律失常、高血壓、心力衰竭等臨床多種心血管疾病的共同病理過(guò)程。病理情況下，長(zhǎng)期激動(dòng)β腎上腺素受體可誘發(fā)心肌細(xì)胞肥大、凋亡以及心肌細(xì)胞壞死等心肌重塑[6]。本研究運(yùn)用異丙腎上腺素誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞肥大的同時(shí)，心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加，同時(shí)伴有細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH和MDA 漏出量增加，表明心肌肥大的發(fā)展與體內(nèi)抗氧化功能減弱以及氧自由基的增多密切相關(guān)。DFMO預(yù)處理后明顯抑制心肌肥大和細(xì)胞凋亡，降低LDH和MDA漏出量，推測(cè)DFMO可能通過(guò)減少心肌細(xì)胞氧自由基生成，降低膜脂質(zhì)過(guò)氧化，增加膜穩(wěn)定性和有氧氧化，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。

生理?xiàng)l件下，多胺能通過(guò)其多價(jià)正電荷與核苷酸、蛋白質(zhì)等生物分子相互作用，從而影響和調(diào)節(jié)其功能。生物體內(nèi)存在一套完整的機(jī)制以調(diào)節(jié)多胺的濃度并維持多胺池的動(dòng)態(tài)平衡。小分子多胺參與眾多病理過(guò)程，如腫瘤細(xì)胞多胺水平增加[7]，腦組織多胺穩(wěn)態(tài)失衡[8]。鳥氨酸脫羧酶是多胺合成反應(yīng)的限速酶，催化鳥氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦罚珼FMO作為鳥氨酸脫羧酶的特異性抑制物，通過(guò)抑制鳥氨酸脫羧酶活性降低細(xì)胞內(nèi)多胺水平，從而減弱許多組織的增生反應(yīng)[9]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞凋亡可能參與心血管疾病，如心肌梗死、心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展。心肌細(xì)胞凋亡導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)量持續(xù)減少，是心肌肥大向心力衰竭轉(zhuǎn)化的重要機(jī)制，細(xì)胞凋亡與眾多基因調(diào)控有關(guān)[10]。抑制肥大心肌的細(xì)胞凋亡率是防治心力衰竭的有效藥物靶點(diǎn)之一。關(guān)于多胺對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響，國(guó)內(nèi)外報(bào)道甚少。Cetrullo等[11]最新研究表明，去甲腎上腺素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞多胺合成限速酶ODC活性增加，同時(shí)伴心肌細(xì)胞凋亡。ODC特異性抑制劑DFMO通過(guò)介導(dǎo)AMP-激活的蛋白激酶等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡。Tipnis 等[12]研究表明DFMO通過(guò)抑制ODC活性，降低多胺含量從而抑制心肌細(xì)胞肥大和纖維化。本研究結(jié)果與上述報(bào)道相似，但DFMO抑制心肌細(xì)胞凋亡時(shí)，如何影響凋亡相關(guān)基因Bcl-2與Bax表達(dá)未見報(bào)道。

Bcl-2 蛋白C 末端由21個(gè)疏水氨基酸組成鏈狀結(jié)構(gòu), 存在于線粒體外膜及胞質(zhì)中。Bcl-2 通過(guò)抑制線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變孔的開放，減少細(xì)胞色素C 及凋亡因子的釋放，并提高線粒體的鈣緩沖能力。Bcl-2 家族對(duì)線粒體內(nèi)一些促凋亡因子的釋放具有重要的調(diào)控作用，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的功能[13]。Bax 是Bcl-2的同源基因，它的過(guò)表達(dá)可拮抗Bcl-2的保護(hù)效應(yīng)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。促凋亡基因Bax 可以與Bcl-2 形成異二聚體, 因此Bax 與Bcl-2 之間的比例可能決定了細(xì)胞凋亡的敏感性。本研究表明，ISO促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡的同時(shí)，Bcl-2/Bax比值明顯下降。DFMO預(yù)處理抑制心肌細(xì)胞凋亡率，同時(shí)上調(diào) Bcl-2/Bax比值。補(bǔ)充多胺后逆轉(zhuǎn)了DFMO對(duì)心肌細(xì)胞Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)。結(jié)果提示DFMO可能通過(guò)抑制促凋亡基因，同時(shí)上調(diào)抗凋亡基因的表達(dá)，保護(hù)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，并進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。 Tantini 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，DFMO 通過(guò)耗竭H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)多胺含量，對(duì)缺血誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制線粒體細(xì)胞色素C 釋放和caspase激活關(guān)系密切，補(bǔ)充外源性腐胺后拮抗DFMO對(duì)心肌的保護(hù)作用。結(jié)合我們的研究表明多胺在心肌缺血和心肌肥大的細(xì)胞凋亡中均發(fā)揮重要作用。

綜上所述，DFMO抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大及凋亡，其作用與Bcl-2、Bax基因和蛋白表達(dá)密切相關(guān)。多胺在心血管方面的作用具有潛在的開發(fā)價(jià)值，許多問(wèn)題還需深入研究。

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Effects of difluoromethylornithine on the cardiomyocytes hypertrophy and apoptosis induced by isoproterenol

LIN Yan1,2,4, XIAO Wei2,LI Bo2, JIN Li2, WANG Guo-zhong2, WANG Jun2，ZHAO Ya-jun3，XU Chang-qing3，LIU Ji-cheng1

(1.InstituteofMedicine, 2.DeptofPathophysiology,QiqiharMedicalUniversity,Qiqihar,Heilongjiang161006,China;3.DeptofPathophysiology,HarbinMedicalUniversity,Harbin150086,China; 4.ITCWMPostdoctorResearchCenterinHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Aim To study the effects of difluoromethylornithine (DFMO) on cardiomyocytes hypertrophy and apoptosis induced by isoproterenol (ISO). Methods The cardiomyocytes were divided into four groups randomly：Control group, ISO group, ISO+DFMO group and (ISO+DFMO+Putrescine) group. The hypertrophic model of cardiomyocytes was induced by ISO, the cardiomyocytes were pretreated with 0.5 mmol·L-1DFMO and 0.5 mmol·L-1putrine, the gene expression of ANP, the surface area of cardiomyocytes and the contents of LDH and MDA were measured. Apoptotic value of cardiomyocytes was observed by Annexin V/PI, the gene and protein expressions of Bcl-2 and Bax were detected by real-time PCR and Western blot. Results Compared with ISO group, the cell surface area, the gene level of ANP, the apoptosis value of cardiomyocytes and the contents of LDH and MDA were decreased in ISO+DFMO group (P<0.05). Meanwhile, DFMO pretreatment upregulated the gene and protein expressions of Bcl-2 (P<0.05), increased the ratio of Bcl-2/Bax (P<0.05), downregulated the gene and protein levels of Bax (P<0.05). Conclusion The cardiomyocyte hypertrophy and apoptosis induced by ISO can be protected by DFMO pretreatment, which may be associated with the expression of apoptotic gene Bcl-2 and Bax.

polyamine; difluoromethylornithine; cardiac hypertrophy; apoptosis;Bcl-2; Bax

時(shí)間：2015-4-15 15:44 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150415.1545.016.html

2015-02-22,

2015-03-27

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81100170, 81170178)；黑龍江省教育廳面上項(xiàng)目(No 12521617)；齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院科研基金資助項(xiàng)目(No QY2014Z-08)

林 巖(1975-)，女，博士，教授，研究方向：心血管疾病的發(fā)病機(jī)制和防治策略，Tel：0452-2663126，E-mail：yanlinqqhr@aliyun.com； 劉吉成(1958-),男,博士,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向:分子藥理學(xué)和腫瘤藥理學(xué),通訊作者,Tel：0452-6731303,Fax:0452-6712437,E-mail:qyybliu@126. com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.05.016

A

1001-1978(2015)05-0668-05

R-332；R322. 11；R329. 25；R542. 202；R977.3；R977.6