耐力運動8周對大鼠骨骼肌收縮功能和線粒體生物合成的影響及機制

邱 霓，李 聰，方偉進，韋雪梅，何玉蓮，熊 燕

(廣州醫科大學藥學院，廣州蛇毒研究所，廣東 廣州 510182)

耐力運動8周對大鼠骨骼肌收縮功能和線粒體生物合成的影響及機制

邱 霓，李 聰，方偉進，韋雪梅，何玉蓮，熊 燕

(廣州醫科大學藥學院，廣州蛇毒研究所，廣東 廣州 510182)

目的 探討8周耐力運動對不同類型骨骼肌收縮功能及線粒體能量代謝能力的影響及其機制。方法 分離經8周平臺跑步訓練的♂ SD大鼠的比目魚肌和趾長伸肌，觀測給予不同方式電刺激后兩種類型骨骼肌收縮能力和抗疲勞能力的變化以及ATP含量和線粒體生物合成相關指標的改變。結果 耐力運動8周可一定程度提高比目魚肌和趾長伸肌在單次電刺激和強直電刺激下的收縮力，明顯改善比目魚肌的抗疲勞能力。ATP含量在兩類肌肉中均明顯升高，但只有比目魚肌線粒體DNA、PGC-1α、NRF基因的轉錄及PGC-1α蛋白明顯上調，并伴隨p-AMPK/AMPK蛋白比值明顯增加。結論 耐力運動8周改善骨骼肌的收縮能力，但僅增加富含氧化型肌纖維的比目魚肌的抗疲勞能力，這可能與耐力運動激活氧化型肌纖維的AMPK，上調PGC-1α轉錄和表達，增加線粒體生物合成有關。

耐力運動；比目魚??；趾長伸??；骨骼肌收縮；線粒體生物合成；大鼠模型

骨骼肌占據了全身約45%的重量，在維持機體能量代謝平衡中起著重要的作用；肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病常伴隨骨骼肌細胞內線粒體功能異常[1-2]。研究表明，肥胖患者骨骼肌線粒體含量減少，呼吸鏈氧化酶活性降低，呼吸能力減弱；2型糖尿病患者在出現代謝相關基因和線粒體基因表達減少之前就已存在骨骼肌氧化磷酸化水平降低的表現[3]。長期耐力運動被證實可有效改善代謝紊亂，降低代謝性疾病所致的死亡率[4]。

骨骼肌是一類可塑性較高的組織，可根據運動強度、時間發生適應性的改變。有證據表明，短期運動主要促進骨骼肌對葡萄糖的攝取，增加肌肉蛋白質的合成，增強肌肉力量；而長期耐力運動則促使肌肉減少對于糖原和高能磷酸物的利用，能量代謝底物從葡萄糖轉變為脂類，乳酸產生減少，從而延緩運動性疲勞的發生[5]。然而，骨骼肌并非由單一類型肌纖維組成，其包括富含線粒體、以有氧代謝為主要能量來源的氧化型纖維和線粒體含量少、以糖酵解方式獲取能量的糖酵解纖維等。不同類型肌纖維中線粒體功能的改變對機體能量代謝狀態的適應性存在差異。有證據表明，肥胖時以糖酵解型肌纖維為主的骨骼肌中線粒體數量升高，表現為線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)、過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α(peroxisome proliferator γ activated receptor coactivator 1α, PGC-1α)、核呼吸因子(nuclear respiratory factor 1/2, NRF 1/2)、線粒體轉錄因子A(mitochondrial transcription factor A, TFAM)等線粒體標志物的含量和表達水平上調；而以氧化型肌纖維為主的骨骼肌中這些指標無顯著變化或下調[6-7]。

現今雖有研究證實運動可改善骨骼肌的線粒體功能，但運動誘發骨骼肌線粒體發生適應性改變的機制尚不明確。因此，本實驗采用連續8周平臺跑步耐力運動后大鼠模型小腿以其富含氧化型肌纖維的比目魚肌(soleus, SOL)和富含糖酵解型肌纖維的趾長伸肌(extensor digitorum longus, EDL)為研究對象，探討長期耐力運動對不同類型骨骼肌收縮和線粒體生物合成的影響及其調控機制，為預防和治療代謝性疾病，維持機體能量代謝平衡提供實驗依據。1 材料與方法

1.1 動物飼養與分組SPF級♂SD大鼠20只，體質量(200±15)g，購自于廣東省實驗動物中心，動物合格證號為SYXK(粵)：2010-0104。所有動物適應性飼養1周后，隨機分為對照組和耐力運動組，每組10只。運動采用平臺耐力跑步訓練法，即每天跑步1次，每周跑步5 d，休息2 d；運動量為每天先以15 m·min-1的速度跑15 min，再以20 m·min-1的速度跑60 min，最后以15 m·min-1的速度跑15 min，連續訓練8周。

1.2 骨骼肌收縮功能測定腹腔注射10%水合氯醛(300 mg·kg-1)麻醉大鼠，迅速分離左側比目魚肌和趾長伸肌，置于預冷充氧的K-H緩沖液中；將骨骼肌條穿過電極刺激環的中央，固定于恒溫37℃、持續充以95% O2和5% CO2混合氣體的K-H緩沖液浴槽中平衡，隨后分別給予單次刺激(10 V電壓、100 ms波寬的脈沖電刺激肌條)、強直刺激[10 V電壓、0.2 ms波寬、60 Hz(比目魚肌)/90 Hz (趾長伸肌)頻率的脈沖電刺激肌條2 s]、疲勞刺激[10 V電壓，0.5 ms波寬，60 Hz(比目魚肌)/90 Hz (趾長伸肌)頻率的脈沖電刺激肌條，電刺激1 s，休息1 s，依次交替地進行，持續120 s]，采用PowerLab八道電生理記錄儀和Labchart7數據采集分析系統控制電刺激強度，并記錄數據。

1.3 骨骼肌ATP含量檢測采用熒光素酶法檢測ATP含量，并通過蛋白含量進行最終標化。取20 mg組織加入200 μL裂解液，然后用機械勻漿器充分勻漿，裂解后4 ℃ 12 000×g離心5 min，取20 μL上清并依據試劑盒說明書進行后續實驗。ATP含量和BCA蛋白測定試劑盒均購于廣州碧云天生物技術有限公司。

1.4 線粒體DNA含量測定酚/氯仿法提取比目魚肌和趾長伸肌的基因組DNA，取總DNA 100 ng為模板，加入到20 μL PCR反應體系中。PCR產物經1.5% 瓊脂糖凝膠電泳后進行凝膠圖像分析，以細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(COX Ⅰ)與β-actin的比值反映線粒體基因的合成情況。引物序列和反應條件如Tab 1所示。

1.5 RT-PCR檢測PGC-1α、NRF 和UCP2基因轉錄TRIzol法提取比目魚肌和趾長伸肌的RNA，取總RNA 500 ng為模板，用TaKaRa公司的逆轉錄試劑盒合成cDNA。取50 ng cDNA加入到20 μL PCR反應體系中。PCR 產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳后進行凝膠圖像分析。引物序列和反應條件如Tab 1所示。

Tab 1 Sequences of forward and reverse primers for genes

1.6 Western blot檢測PGC-1α、磷酸化AMPK和總AMPK蛋白的表達取50 mg 比目魚肌和趾長伸肌樣本，置于500μL預冷的RIPA裂解液中，冰上電動勻漿20s，于4 ℃以12 000×g離心15 min，留取上清，并取30 μg蛋白進行檢測。通過ChemiDoxTMXRS+凝膠成像系統采集圖像，使用Image J軟件進行灰度掃描。其中PGC-1α抗體購自Abcam公司，p-AMPK(Thr172)、AMPK抗體購自Cell Signaling公司。

2.1 大鼠骨骼肌收縮功能的變化運動干預8周后，無論是比目魚肌還是趾長伸肌，給予單次刺激和強直刺激，其收縮能力均呈增強趨勢(見Fig 1A-B)。另外，與對照組相比，運動組的比目魚肌抗疲勞能力增加，但趾長伸肌的抗疲勞能力無明顯改善(見Fig 1C-D)。

2.2 大鼠骨骼肌ATP含量的改變與對照組相比，8周運動干預均可提高比目魚肌和趾長伸肌內的ATP含量，其中比目魚肌內ATP含量升高約2倍(P<0.05)，而趾長伸肌內ATP含量增加達3倍左右(P<0.01),見Fig 2A-B。

Fig 1 Endurance exercise for 8 weeks increased muscle contractility in SOL and ±s,n=4～5)

A: Twitch tension in SOL and EDL with or without exercise intervention for 8 weeks; B: Titanic tension in SOL and EDL with or without exercise intervention for 8 weeks; C: Percentage of initial force after fatigue stimulation for 120s in SOL; D: Percentage of initial force after fatigue stimulation for 120s in EDL.*P<0.05vscontrol group.

Fig 2 ATP contents increased in SOL(A) and EDL(B) after exercise intervention for 8 ±s,n=4～5)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

2.3 運動8周對大鼠骨骼肌線粒體DNA的影響采用COX I與細胞核內β-actin DNA比值以反映線粒體DNA含量。運動干預8周的比目魚肌內COX I/β-actin的比值明顯增加(P<0.05)，而趾長伸肌內COX I/β-actin比值無變化(Fig 3A-B)，這些結果提示8周耐力運動僅對比目魚肌線粒體生物合成有促進作用。

2.4 骨骼肌PGC-1α及下游基因mRNA表達水平的改變8周耐力運動可明顯上調比目魚肌內PGC-1α及其下游NRF基因的mRNA水平(P<0.01)，但對趾長伸肌中PGC-1α和NRF基因的轉錄無明顯影響。另外，8周耐力運動可明顯下調比目魚肌和趾長伸肌中UCP2 mRNA水平(P<0.05),見Fig 4A-B。

2.5 骨骼肌PGC-1α蛋白表達水平的改變與對照組相比，8周耐力運動上調比目魚肌中PGC-1α蛋白水平(P<0.05)，但不影響趾長伸肌中PGC-1α蛋白表達(Fig 5A-B)。

2.6 骨骼肌AMPK的表達變化耐力運動組比目魚肌中p-AMPK/AMPK比值較對照組明顯升高(P<0.05)，提示AMPK被激活(Fig 6A)。但p-AMPK/AMPK比值在趾長伸肌內未出現明顯的改變(Fig 6B)。

3 討論

本研究發現耐力運動8周增加比目魚肌和趾長伸肌對單次刺激和強直刺激的反應性，提高比目魚肌的抗疲勞能力，提示運動改善骨骼肌的收縮能力，在富含氧化型肌纖維的比目魚肌中尤為顯著。眾所周知，骨骼肌收縮需要ATP提供能量，而線粒體是ATP產生的主要場所，因此線粒體功能的變化將直接影響骨骼肌的收縮能力。

Fig 3 Effect of endurance exercise for 8 weeks on mithochondrial DNA contents in SOL(A) and EDL(B) of ±s,n=4)

*P<0.05vscontrol group.

Fig 4 Effect of endurance exercise for 8 weeks on mRNA expression of PGC-1α, NRF, UCP2 and

*P<0.05vscontrol group

Fig 5 Effect of endurance exercise for 8 weeks on PGC-1α

*P<0.05vscontrol group.

線粒體功能的變化包括ATP含量和/或線粒體生物合成的變化。PGC-1α，線粒體生物合成的關鍵調控因子，其主要分布于高氧化代謝的組織中，如肝臟、棕色脂肪、心臟、骨骼肌等，在骨骼肌中以氧化型肌纖維表達最高。PGC-1α可協調和輔助眾多輔轉錄因子(如NRF1和2、PPAR、Tfam等)，促進線粒體核基因轉錄，誘導線粒體DNA含量和線粒體復制增加[8-9]。有證據顯示，過表達PGC-1α可誘導小鼠糖酵解型肌纖維向氧化型肌纖維轉化，同時伴隨著細胞色素C和細胞色素氧化酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ及ATP合成酶表達增加；相反，PGC-1α基因敲除的小鼠骨骼肌內線粒體體積減小，線粒體呼吸鏈蛋白、ATP合成酶表達，ADP刺激呼吸能力下降[10-11]。PGC-1α的表達和活性主要受腺苷酸活化蛋白激酶(5’-AMP-activated protein kinasein，AMPK)調控。AMPK可直接磷酸化PGC-1α，從而增加PGC-1α mRNA和蛋白的表達，觸發PGC-1α信號級聯，誘導線粒體生物合成。AMPK被稱為細胞能量調節器，在維持能量供需平衡中起著重要作用。在能量匱乏或對能量需求增加時，AMP/ATP比值增加，AMPK被激活，導致產生ATP的分解代謝途徑啟動，而消耗ATP的合成代謝途徑被抑制。大量的研究提示，AMPK活化呈現運動時間依賴性和運動強度依賴性，長期運動不僅提高運動狀態下骨骼肌的AMPK活性，也能提高骨骼肌安靜狀態下AMPK的活性[12-13]。無論是一次性急性運動、高強度間歇運動還是長期耐力運動均可提高骨骼肌PGC-1α mRNA和蛋白表達水平[14-16]。本研究結果顯示，8周耐力運動增加比目魚肌中線粒體基因COX Ⅰ與核基因β-actin拷貝數的比值、PGC-1α和NRF mRNA水平、PGC-1α蛋白水平，伴隨p-AMPK/AMPK比值升高；然而，趾長伸肌內未觀察到線粒體生物合成相關指標和p-AMPK/AMPK比值的改變，提示8周耐力干預僅對富含氧化型肌纖維的比目魚肌內線粒體生物合成有促進作用，出現差異的原因可能與運動對小腿骨骼肌類型存在一定選擇性有關。

Fig 6 Effect of endurance exercise for 8 weeks on p-AMPK and total AMPK protein expression

*P<0.05vscontrol group.

ATP含量不僅與線粒體數量有關，還與線粒體的呼吸速率密不可分[17]。解偶聯蛋白(uncoupling proteins，UCPS)作為線粒體內膜質子轉運蛋白，當它被激活時，可產生質子滲漏，使氧化磷酸化解偶聯，ATP合成降低，導致產能作用轉化為產熱作用。UCP2表達下調，導致質子漏和ATP合成之間進行快速轉換，在不依賴于底物代謝和線粒體呼吸增加的情況下，提高線粒體呼吸速率，促使ATP得以快速大量產生[18-19]。本研究發現，8周耐力運動明顯下調趾長伸肌內UCP2 mRNA的表達，增加ATP含量，但線粒體生物合成相關指標未發生變化，推測線粒體呼吸速率改善是趾長伸肌內ATP含量增加的一個主要原因。

綜上所述，本研究表明耐力運動8周增加比目魚肌的收縮能力和抗疲勞能力，這與氧化型肌纖維內AMPK被激活，上調PGC-1α，增加線粒體生物合成有關。但8周耐力運動僅一定程度增加趾長伸肌的收縮能力，這與線粒體氧化呼吸速率改善，導致ATP含量增加有關。

[1] Hojlund K, Mogensen M, Sahlin K, et al. Mitochondrial dysfunction in type 2 diabetes and obesity[J].EndocrinolMetabClinNorthAm, 2008, 37(3):713-31.

[2] Phielix E, Mensink M. Type 2 diabetes mellitus and skeletal muscle metabolic function[J].PhysiolBehav, 2008, 94(2):252-8.

[3] Ritov V B, Menshikova E V, Azuma K, et al. Deficiency of electron transport chain in human skeletal muscle mitochondria in type 2 diabetes mellitus and obesity[J].AmJPhysiolEndocrinolMetab, 2010, 298(1):E49-58.

[4] Joseph A M, Hood D A. Relationships between exercise, mitochondrial biogenesis and type 2 diabetes[J].MedSportSci, 2014, 60:48-61.

[5] Wisdom K M, Delp S L, Kuhl E. Use it or lose it: multiscale skeletal muscle adaptation to mechanical stimuli[J].BiomechModelMechanobiol, 2015,14(2):195-215.

[6] Holmstrom M H, Iglesias-Gutierrez E, Zierath J R, et al. Tissue-specific control of mitochondrial respiration in obesity-related insulin resistance and diabetes[J].AmJPhysiolEndocrinolMetab, 2012, 302(6):E731-9.

[7] Gomez-Perez Y, Capllonch-Amer G, Gianotti M, et al. Long-term high-fat-diet feeding induces skeletal muscle mitochondrial biogenesis in rats in a sex-dependent and muscle-type specific manner[J].NutrMetab(Lond), 2012, 9:15.

[8] Chan M C, Arany Z. The many roles of PGC-1alpha in muscle——recent developments[J].Metabolism, 2014, 63(4):441-51.

[9] 郭 茜,郭家彬,李 梨,等. PGC-1α與線粒體生成調控在心血管疾病中的作用[J]. 中國藥理學通報,2013,29(1):1-4.

[9] Guo Q,Guo J B,Li L,et al. Role of PGC-1α and mitochondrial biogenesis in cardiovascular diseases[J].ChinPharmacolBull, 2013,29(1):1-4.

[10] Arany Z, He H, Lin J, et al. Transcriptional coactivator PGC-1 alpha controls the energy state and contractile function of cardiac muscle[J].CellMetab, 2005, 1(4):259-71.

[11] Leone T C, Lehman J J, Finck B N, et al. PGC-1α deficiency causes multi-system energy metabolic derangements: muscle dysfunction, abnormal weight control and hepatic steatosis[J].PLoSBiol, 2005, 3(4):e101.

[12] Lantier L, Fentz J, Mounier R, et al. AMPK controls exercise endurance, mitochondrial oxidative capacity, and skeletal muscle integrity[J].FASEBJ, 2014, 28(7):3211-24.

[13] Jorgensen S B, Richter E A, Wojtaszewski J F. Role of AMPK in skeletal muscle metabolic regulation and adaptation in relation to exercise[J].JPhysiol, 2006, 574(Pt 1):17-31.

[14] Lin J, Wu H, Tarr P T, et al. Transcriptional co-activator PGC-1 alpha drives the formation of slow-twitch muscle fibres[J].Nature, 2002, 418(6899):797-801.

[15] Perez-Schindler J, Summermatter S, Santos G, et al. The transcriptional coactivator PGC-1alpha is dispensable for chronic overload-induced skeletal muscle hypertrophy and metabolic remodeling[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2013, 110(50):20314-9.

[16] Popov D V, Bachinin A V, Lysenko E A, et al. Exercise-induced expression of peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1alpha isoforms in skeletal muscle of endurance-trained males[J].JPhysiolSci, 2014, 64(5):317-23.

[17] Casas M, Buvinic S, Jaimovich E. ATP signaling in skeletal muscle: from fiber plasticity to regulation of metabolism[J].ExercSportSciRev, 2014, 42(3):110-6.

[18] Boss O, Hagen T, Lowell B B. Uncoupling proteins 2 and 3: potential regulators of mitochondrial energy metabolism[J].Diabetes, 2000, 49(2):143-56.

[19] Schlagowski A I, Singh F, Charles A L, et al. Mitochondrial uncoupling reduces exercise capacity despite several skeletal muscle metabolic adaptations[J].JApplPhysiol(1985), 2014, 116(4):364-75.

Effects and mechanisms of endurance exercise for 8 weeks on contractile function and mitochondrial biogenesis in rat skeletal muscles

QIU Ni, LI Cong, FANG Wei-jin, WEI Xue-mei, HE Yu-lian, XIONG Yan

(GuangzhouResearchInstituteofSnakeVenomandSchoolofPharmaceuticalSciences,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510182,China)

Aim This study was aimed to explore the influence and mechanism of the long-term exercise on skeletal muscle contraction and mitochondrial biosynthesis in different muscle fibers. Methods Soleus (SOL) and extensor digitorum longus (EDL) were isolated from SD male rats with platform running training for eight weeks. The changes of contractility under different electrical stimulation were observed, mitochondrial biosynthesis, including ATP content, mitochondrial DNA, the gene expression of PGC-1α and NRF were also detected. Results Long-term endurance exercise can improve twitch tension and titanic tension of SOL and EDL , but only enhanced the fatigue resistance in SOL. ATP contents were significantly increased in the two types of muscles, but mtDNA content, PGC-1α expression and NRF translation were only obviously enhanced in SOL, in accompanied with an increase in p-AMPK/AMPK protein ratio. Conclusion Long-term endurance exercise increased skeletal muscle contractility and improved the anti-fatigue ability in SOL, which may be associated with increase in mitochondrial biosynthesis via activated AMPK-PGC-1α axis.

endurance exercise; soleus; extensor digitorum longus; skeletal muscle contractility; mitochondrial biosynthesis; rat model

時間：2015-4-15 15:44 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150415.1545.021.html

2015-02-21,

2015-03-24

國家自然科學基金資助項目(No 81170778)；廣東省科技計劃(No 2013B21800098)；廣州市科技計劃(No 2014J4100067)

邱 霓(1981-)，女，博士后，講師，研究方向：代謝性疾病，E-mail：qiuni1016@163.com; 熊 燕(1960-)，女，博士，教授，研究方向：心血管和代謝性疾病，通訊作者，E-mail: xiongyan2001@yahoo.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.05.020

A

1001-1978(2015)05-0691-07

R-332；R322.74；R329.24；R336；R337.2