激光捕獲顯微切割技術純化的乳腺癌上皮細胞和間質比較蛋白質組學研究

徐學清,劉叔文

(南方醫科大學藥學院,廣東 廣州 510515)

激光捕獲顯微切割技術純化的乳腺癌上皮細胞和間質比較蛋白質組學研究

徐學清,劉叔文

(南方醫科大學藥學院,廣東 廣州 510515)

目的 研究乳腺癌上皮細胞和間質間蛋白表達的差異。方法 用改良HE染色法對臨床侵潤性導管內原位癌患者的石蠟包埋樣品進行染色，用激光捕獲顯微切割技術(LCM)純化分離癌變的乳腺上皮細胞和其周圍間質后分別進行質譜分析。結果 質譜總共檢測了431種蛋白，上皮細胞和間質中分別檢測到384和298種蛋白。251種共同表達的蛋白中，69種間質蛋白的含量比在上皮細胞中高，60種比在上皮細胞中低。所檢測到蛋白的上皮細胞和間質定位及表達水平和它們在腫瘤發生、發展過程中的作用一致。結論 在上皮細胞和間質中差異表達蛋白可以是疾病的篩選、診斷和預后判斷的蛋白標志。

乳腺癌；腫瘤微環境；間質；激光捕獲顯微切割；乳腺上皮細胞；質譜

自2008年以來，乳腺癌每年在世界范圍內的發病率和死亡率分別為20%和14%，是婦女最常見的癌死亡病因[1]。惡性腫瘤的發生不僅僅是腫瘤細胞自身的問題，而且與其間質關系密切[2-3]。間質是腫瘤生長的微環境，由正常細胞和腫瘤細胞分泌的細胞外蛋白和非轉化的宿主細胞組成。間質變化以細胞外基質蛋白和細胞組分的改變為特征，其在乳腺發育、哺乳和乳腺癌過程中發生。通常腫瘤乳腺間質和正常乳腺間質不同，腫瘤乳腺硬度增長是細胞外基質蛋白數量和質量改變的結果，并導致導管上皮內信號通路組分改變，促進了腫瘤的發生、生長和轉移[2-3]。目前的研究比較了間質樣品間的基因或蛋白表達差異、乳腺上皮細胞間的基因或蛋白表達差異、不同來源的組織(如福爾馬林石蠟包埋、冰凍樣品、或者實驗不同的平臺)間蛋白表達差異[2-10]。盡管這些研究解決了各種上皮間、間質間的蛋白/基因表達差異，但是卻不知道間質和上皮細胞間的蛋白表達差異；也有研究用包括了細胞類型混合物的手術解剖樣品比較腫瘤組織和正常組織間的蛋白或基因表達差異，但由于上皮細胞的蛋白或基因表達數據被附近間質組分的數據稀釋，導致結果模糊，很難解釋[11]。因此，腫瘤組織內蛋白表達差異的真正評估需要細胞特異性比較。

在本研究中，激光捕獲顯微切割技術(LCM)和質譜被用于比較浸潤性導管內原位癌間質和乳腺上皮細胞間的蛋白表達差異。該蛋白組學研究結果鑒定了侵潤性導管內原位癌間質和上皮細胞中表達豐富的蛋白，確定以前被認為表達已經改變的蛋白和基因是否真實存在和突出了乳腺癌瘤診斷和預后標志蛋白的具體定位。本研究為乳腺癌蛋白質組學研究提供了重要的信息和資料，將有助于理解乳腺癌內發生作用的細胞信號通路，乳腺腫瘤細胞侵入和轉移的機制，有助于鑒定與腫瘤診斷和預后密切相關的蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與設備 蘇木精、伊紅、無水乙醇、二甲苯、尿素、福爾馬林等均為國產分析純。石蠟包埋劑、帶PEN膜的載片、LCM專用Eppendorf管、CM1900冰凍切片制作儀、激光捕獲顯微切割儀系德國Leica公司產品。NanoDrop 2000、-86℃超低溫冰箱和帶電子轉移裂解源的離子阱-軌道阱組合型高分辨質譜儀美國Thermo公司產品；Liquid Tissue MS Protein Prep試劑來自美國Expression Pathology公司。

1.1.2 材料和樣品準備 手術切除的侵潤性導管內原位癌組織樣品先置液氮中速凍，后置于-80℃冰箱保存備用，整個樣品采集過程耗時控制于30 min內。組織樣品從-80℃低溫冰箱取出后，迅速進行福爾馬林固定、石蠟包埋過程，然后用切片機切成8 μm厚，進行HE染色。方法如下：蘇木精10～15 s，撈片置于冰水沖洗10～15 s，伊紅15 s，用體積分數為0.85、0.95乙醇各20 s，2次無水乙醇15 s梯度脫水，2次二甲苯1 min透明，室溫完全干燥。上述染色過程在冰盒中進行，染液溫度控制于(4～10)℃，總時間控制在10 min內。完畢后進行激光捕獲。

1.1.3 激光捕獲 將染色完好切片置于Leica AS顯微激光切割系統，10×10倍目鏡直視觀察，重點觀察細胞形態和染色情況。找到細胞密集、形態較好、染色滿意區域，安置收集管；根據視野、放大倍數及目的細胞分布等調整激光束的直徑和功率，在合適的倍率下分別選上皮細胞和間質組分進行收集，總捕獲時間不超過40 min。

1.1.4 質譜分析 將捕獲細胞的塑料帽扣在裝有組織裂解液的0.5 mL離心管上，在室溫下倒置約5 min，4℃裂解1 h，12 000 r·min-1、4℃離心45 min，取上清液為組織細胞總蛋白，NanoDrop 2000測定總蛋白含量。然后按照說明書用Liquid Tissue MS Protein Prep處理后進行質譜分析。質譜時，1 μg處理好的樣品被注入C18反相柱，洗脫用乙晴/0.1 mol·L-1醋酸，在濃度梯度體積分數為0.02～0.8，流速為0.5 μL·min-1洗脫90 min。洗脫下的樣品，通過2.5 kV離子源電噴霧源直接進入質譜儀。質譜儀被設定為獲得完全掃描質譜以分析肽分子量，然后以20離子掃描譜以鑒定洗脫肽氨基酸序列。Orbitrap XL質譜的參數設定為：毛細管溫度為265℃；FT AGC為9E5, 1 uscan；FT最大離子時間為500 ms；IT AGC為8E3；IT最大離子時間為100 ms；ms/ms trigger為1 000 counts；隔離寬度為3；以常態化碰撞能量為35；活化時間為10 ms；重復點數為1；重復周期30 s；排除列表為200；排除周期為60 s。質譜產生的數據用Proteome Discoverer 1.4.1搜索Uniprot人類蛋白組數據庫，搜索結果通過如下數據過濾處理后載入Scaffold V 4.3.4：唯一肽≥2、肽Prophet積分> 60%、蛋白Prophet積分> 95%、Xcorr> 1.8 (+1), 2.2 (+2), 2.5 (+3) 和3.5 (+4或更大)。雙尾Fisher精確檢驗測定P值。

2 結果

2.1 激光捕獲顯微切割的上皮細胞和間質從Fig 1來看，切片用HE方法染色后能獲得細胞形態完整、對比度好、腫瘤細胞和間質可清楚區分的合格切片，能夠用激光顯微切割分離細胞和間質。切割下來的細胞和間質經裂解和NanoDrop 2000測定后總蛋白含量分別為45.1 μg和52.4 μg。Fig 1A為切割如下上皮細胞前的圖片；Fig 1B切割下來的乳腺癌上皮細胞；Fig 1C為切割下來的乳腺上皮細胞(10×40)；Fig 1D切割間質前的圖片；Fig 1E切割乳腺癌患者間質后的圖片；Fig 1F間質和癌乳腺上皮切割前的圖片。

Fig 1 Laser microdissection of breast stroma and epithelial cells

A: Epithelial cells before microdissection; B: Epithelial cells after microdissection; C: Epithelial cells after microdissection oberserved with 40× magnification; D: Stroma before microdissection; E: Stroma after microdissection; F: Stroma and epithelial cells before microdissection

2.2 上皮細胞和間質蛋白的質譜分析從質譜的Q-Q散布曲線上的散點圖看，整個圖呈現較為集中的趨勢，絕大多數共同表達蛋白位于45度角平分線附近，而差異表達蛋白發生偏離，可清晰、明顯的反映樣本之間的變化，可以比較兩個樣品組間的相互關系和蛋白分布的大體輪廓(Fig 2)。因此數據的可重現性好，對比的變異程度突出，質譜結論能用于生物學解釋。

Fig 2 Q-Q scatterplot of stroma/epithelial cells

從Fig 3可以看出，質譜總共檢測了431種蛋白，上皮細胞和間質中分別檢測到384和298種蛋白，在兩中樣品間共同表達的蛋白有251種。Tab 1列出了間質和上皮細胞中被鑒定含量最高的50種蛋白對。兩組樣品蛋白表達進行詳細分析發現，僅在間質內表達的蛋白包括Complement C3 (Fragment)、Collagen type V alpha 1、Forkhead box protein F1、Isoform 1 of USH1C-binding protein 1、Isoform 1 of receptor-type tyrosine-protein phosphatase H、ASPN protein、Histone H2A type 1-B/E、Elongation factor 1-alpha 2、Hemoglobin subunit delta、Isoform 1 of Filamin-C、Histone deacetylase 1、Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3、Serotransferrin、Isoform 2 of Trinucleotide repeat-containing gene 6A protein、Putative uncharacterized protein HSPG2、Conserved hypothetical protein等，而僅在上皮細胞中表達的蛋白有Keratin type II cytoskeletal 5、Keratin type I cytoskeletal 19、Keratin type I cytoskeletal 10、Keratin type II cytoskeletal 2 epidermal、Keratin type I cytoskeletal 15、Keratin type I cytoskeletal 16、keratin 7、Fructose-bisphosphate aldolase A、Heat shock protein beta (Fragment)、Alpha-actinin-4、Polymeric immunoglobulin receptor、Heat shock 70 kDa protein 1、Keratin, type I cytoskeletal 17、Basement membrane-specific heparan sulfate proteoglycan core protein、Carbonic anhydrase 2等。在二者共同表達的251種蛋白中，他們的含量在兩種樣品中不同，69種間質蛋白的含量比在上皮細胞中高，60種比在上皮細胞中低。

Fig 3 Venn diagram of protein spectrum

為了充分分析上皮細胞和間質間差異表達蛋白的類型，用基因本體(GO)比較分析了上皮細胞和間質表達蛋白的功能。從Fig 4可以看出：在上皮細胞表達的細胞組分蛋白中，除細胞骨架蛋白和細胞外區蛋白比間質含量低外，其他如細胞器、細胞質、內質網相關的蛋白等都比間質含量高；在生物學過程相關的蛋白中，生物學吸附和調節，細胞增殖、繁殖、移動、發育過程的蛋白的含量在細胞中要低于在間質中，而細胞過程、定位確立、定位、代謝和對刺激反應過程的蛋白在細胞中含量明顯要高于在間質中。在上皮細胞表達的分子功能蛋白中除附屬運輸蛋白活性、酶調節活性和運輸活性的蛋白比間質含量低外，其他蛋白都比間質中高。

Tab 1 50 most abundant proteins identified from laser microdissection of breast stroma and epithelial cells

NoEpithelialcellsIdentifiedproteinsAccessionnumberMW/kuQuantitativevalueIdentifiedproteinsStromaAccessionnumberMW/kuQuantitativevalue42L-lactatedehydrogenaseIPI002179664012.33HistoneH1.2IPI00217465218.54343AnnexinA5IPI003298013611.559HistoneH2Btype2-EIPI00003935148.54344PutativeuncharacterizedproteinIPI005507312611.559SLC15A3proteinIPI00807372348.54345tropomyosin1alphachainisoform2IPI000002303311.559HemoglobinsubunitalphaIPI00410714158.54346Keratin,typeIcytoskeletal16IPI002179635111.559SNC66proteinIPI00383164547.11947EndoplasminIPI000272309210.789tropomyosin1alphachainisoform2IPI00000230337.11948HistoneH3.2IPI001716111510.018HistoneH3.2IPI00171611157.11949ATPsynthasesubunitbeta,mitochon-drialIPI003034765710.018Isoform1ofHeatshockcognate71kDaproteinIPI00003865717.11950HistoneH2A.VIPI00018278149.247BiglycanIPI00010790427.119

Fig 4 The GO of proteins from stoma and epithelial cells

The red columns are the GO of epithelial cells and the blue ones represent that of the stroma

3 討論

乳腺間質組分的改變被認為是宿主對腫瘤發生和進展反應的結果，并會引起腫瘤上皮細胞蛋白表達譜產生相應的改變，因此腫瘤和間質間的相互反應對于腫瘤的發生和進展很重要。涉及腫瘤和間質間反應的蛋白可能是研究診斷方法、治療手段和預后判斷的靶點。為了理解間質和細胞間的反應，有必要細化上皮細胞和間質間蛋白表達的異同，找到標志性蛋白。Ma等[5]發現乳腺癌患者的上皮細胞和間質的基因表達在局部侵襲發生前都明顯改變，在導管原位癌和侵襲性導管原位癌轉變過程中沒有變化發生。但是二者在蛋白表達水平上的差異卻沒有被驗證。在本研究中，激光捕獲顯微切割技術和質譜分析鑒定的蛋白絕大部分都在癌癥研究的文獻中被報道過。并且它們的出現位置以及表達水平和它們在腫瘤發生、發展過程中的作用一致。因此質譜和顯微切割技術是分析腫瘤細胞和間質蛋白間表達差異的有效方法，能對一些作為診斷和預后判斷的分子標志蛋白進行細胞定位。

間質蛋白主要由細胞外間質蛋白和細胞組分如，成纖維為細胞、巨噬細胞、內皮細胞、白細胞等的蛋白構成。膠原是比較大的細胞外間質蛋白，其在腫瘤內形成纖維和網絡，對腫瘤的生長和轉移有重要影響，能作為預后標志。在目前的研究中，Ⅴ型膠原的alpha 1和2鏈僅在間質中被檢測到，Ⅵ型膠原的alpha-1、alpha-2、alpha-3和Ⅰ型膠原alpha-1、alpha-2鏈以及Ⅲ型和XIV 型膠原的alpha-1鏈異位體1在兩種樣品中都被檢測到，但是他們在間質中的含量要遠遠高于在上皮細胞中。此外，與膠原密切相關蛋白如lamini、periostin、vitronectin等也在間質中檢測到。所有這些蛋白均在癌癥中有重要作用，如Ⅰ型膠原alpha-1前體和Ⅻ型膠原alpha-1都是預后標志；在間質中檢測到的多域蛋白periostin能和Ⅰ型膠原反應，改變periostin的結構將猛烈改變細胞外間質蛋白的結構[12]；小亮氨酸重復蛋白家族成員mimecan在間質和上皮細胞中都有表達，但是其在間質中的含量明顯高于在上皮細胞中。mimecan能與膠原反應，使膠原免受蛋白酶切割。因此，mimecan是腫瘤侵入標志[13]。與間質蛋白的反應類似，宿主乳腺上皮細胞發生轉化后，其蛋白表達譜明顯改變，并能作為腫瘤密預后標志。角蛋白是上皮細胞的主要結構蛋白，構成細胞質中間絲。他們的表達結構和潛在的生物學密切相關[14-15]。keratins 5/6、7/8和13-19因在腫瘤生長和轉移過程有重要作用而可以作為預后標志和新生學分類標志[14-15]。在目前的研究中，18種角蛋白和其相關蛋白在侵潤性原位癌的乳腺上皮細胞內被鑒定。該事實進一步證實這些分子可以作為預后的標志。

目前對許多可以作為乳腺癌診斷和預后標志的蛋白的細胞和間質定位不清楚。在目前的研究中，除膠原和Keratin外，許多其他功能明確的蛋白的細胞和間質定位也被確定。例如，僅間質中被檢測到的蛋白中，Galectin-1能為腫瘤提供免疫抑制環境并促進腫瘤免疫逃逸[16]；CD44腫瘤轉移中有作用，可以作為預后不良的標志[17]；RpS3是真核細胞40S核糖體亞單位的主要組分，在核酸內切酶破壞中有重要作用[17]；叉頭蛋白F1的過表達與間葉細胞表型密切相關，能促進腫瘤侵入和轉移[18]；ASPN蛋白在乳腺導管癌的局部侵入中有重要作用；補體C3是乳腺癌檢測和判斷的生物標志[19]。而僅在上皮細胞中被檢測到的蛋白中，碳酸酐酶IX是乳腺癌診斷后預后判斷的生物標志[20]；ACTN4是乳腺癌發生的多用途啟動子[21]；Peroxiredoxin-1和5是雌激素受體陽性乳腺癌的生物標志。而癌癥病人的預后標志線粒體ATP合酶亞beta單位；與疾病進展密切相關Tubulin beta-1鏈[22]；表達升高促進了藥物抗性和轉移的熱激蛋白5和90；在乳腺癌的起始和形成中有重要作用的Clusterin和gelsolind的異位體1[23]；乳腺癌新輔助化療的代謝反應標志L-乳酸脫氫酶B等盡管也在間質中被檢測到[24]，但是它們在上皮細胞中的含量顯然更高。不同的是，與乳腺癌細胞啟動子甲基化下調密切相聯的聚合酶1和轉錄釋放因子在間質中的含量更高。

在目前的研究中，一些和以往研究報道不同的有趣現象存在。首先，一些蛋白的表達定位發生改變，例如，參與上皮細胞遷移的細胞骨架蛋白vimentin是間葉細胞的標志，其過表達加速腫瘤生長、侵襲和差預后。組織學檢查乳腺癌樣品發現vimentin主要在低雌激素的導管癌上皮細胞內表達[25]。此外，miRNAs表達調節的核蛋白nucleolin和乳腺癌預后的重要因子HDAC1也通常只在乳腺腫瘤上皮細胞內過表達[26-27]。但目前在間質中都檢測到這3種蛋白，并且上皮細胞中檢測不到HDAC1，vimentin在間質中的含量要遠高于上皮細胞中。其次，個別蛋白的表達譜發生改變，例如，在目前的研究中，除檢測到與腫瘤密切相聯系的Myosin 2、9、10外，Myosin light chain 6B、Myosin regulatory light chain 12B也被發現，且他們在細胞中含量比間質中高；而過表達與腫瘤密切相關的peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP4沒有被檢測到，但卻檢測到Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase-like 6。最后，在目前的研究中，一些在乳腺癌中沒有報道的癌癥預后標志被檢測到，如卵巢癌癥的預后標志Apolipoprotein A-I，前列腺癌的預后判斷標志prolargin，甲狀腺癌細胞的候選標志ALDH9A1等。這些與以往研究不同的現象可能源于研究材料來源不同和蛋白表達存在種群差異，另外，這也可能與基因分析結果和蛋白表達不一致有關。因為目前對腫瘤標志蛋白的表達定位，表達譜大部分是基于基因表達譜分析，而我們的結果是基于蛋白組學研究。因此不同不可避免存在。

總之，許多差異表達的蛋白在兩個樣品中被觀察到，在二者間不同的蛋白可能突出了他們在腫瘤進展過程中有重要作用。這些不同的蛋白組分可能作為乳腺組織腫瘤發生的標志。可用于鑒定乳腺癌的篩選、診斷、預后和治療方法檢測候選標志。

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Comparative proteome research of epithelial cells and stroma from invasive ductal carcionma patients

XU Xue-qing, LIU Shu-wen

(SchoolofPharmaceuticalSciences,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

Aim To study the difference of proteins expression of epithelial cells and stroma of breast cancer patients. Methods Formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples from invasive ductal carcionma patients were stained by improved HE staining methods. And the neoplastic epithelium and stroma were microdissected using laser capture microdissection and analysed by mass spectrometry. Results Total 431 different proteins were detected by mass spectrometry and there were respectively 384 and 298 different kinds of proteins identified in epithelial cells and stroma. Among them, 251 proteins were commonly expressed in two samples, while the contents of 69 and 60 proteins in stroma were respectively higher or lower than the ones in epithelial cells. The expression level and localization of proteins identified in epithelial cells and stroma were associated with their roles in development and progression of tumor cells. Conclusions The differential expression proteins between epithelial cells and stroma of invasive ductal carcionma patients may function as biomarkers for breast cancer screenning, diagnosis and prognosis.

breast cancer; tumor microenvironment; stroma; laser capture microdissection; mammary epithelium; mass spectrometry

時間：2015-4-15 15:44 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150415.1545.022.html

2015-01-07,

2015-02-01

國家自然科學基金資助項目(No 31370782)；廣東省優秀青年教師培養計劃項目資助

徐學清(1978-)，男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：微生物與生化藥學,E-mail: Xu2003@smu.edu.cn; 劉叔文(1972-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：抗病毒與免疫學，E-mail:liusw@smu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.05.021

A

1001-1978(2015)05-0697-07

R341；R394.3；R737.9；R977.6