內嗎啡肽-1對人樹突狀細胞TLR2和TLR4表達的影響

楊麗娟，潘治宇，陳 勇，陶志勇，夏 惠，李正紅

(蚌埠醫(yī)學院1.生理學教研室、2. 安徽省感染與免疫重點實驗室，安徽 蚌埠 233030)

內嗎啡肽-1對人樹突狀細胞TLR2和TLR4表達的影響

楊麗娟1，潘治宇1，陳 勇2，陶志勇2，夏 惠2，李正紅1

(蚌埠醫(yī)學院1.生理學教研室、2. 安徽省感染與免疫重點實驗室，安徽 蚌埠 233030)

目的 觀察內嗎啡肽-1(EM-1)對人外周血來源樹突狀細胞TLR2和TLR4表達的影響。方法 從人外周血中提取和分離單核細胞，在含重組人粒-巨噬細胞集落刺激因子和重組人白細胞介素-4的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，6 d后未成熟樹突狀細胞(imDC)分4組，空白對照組(BLA組)、EM-1組、LPS組、LPS+EM-1組。繼續(xù)培養(yǎng)2 d后，流式細胞術檢測各組DC表面TLR2、TLR4蛋白的表達；RT-PCR法檢測各組DC中TLR2 mRNA、TLR4 mRNA的表達。結果 流式結果顯示，TLR2、TLR 4在imDC表達較高，隨著DC成熟表達下降。與BLA組相比，EM-1組DC表面TLR2、TLR4的表達下調(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+EM-1組DC表面TLR2、TLR4受體均明顯下調(P<0.01)。RT-PCR的結果顯示，與BLA組相比，EM-1干預后引起DC 表面TLR2 mRNA表達明顯降低(P<0.01)，TLR4 mRNA的變化無差異(P>0.05)；與LPS組相比，LPS+EM-1組 DC表面TLR2 mRNA、TLR4 mRNA均有所下調(P<0.05)。結論 EM-1使DC表面TLR2、TLR4的表達下調，EM-1對DC免疫功能的影響可能與DC表面TLR2、TLR4表達有關。

內嗎啡肽-1；樹突狀細胞；TLR2；TLR4；免疫功能；抗原提呈細胞

樹突狀細胞(dendritic cells, DC)由美國學者Steinman于1973年發(fā)現，因其在成熟時伸出許多樹突狀或偽足狀突起而得名[1]，是迄今所知的抗原提呈能力最強大的抗原提呈細胞(antigen presenting cell,APC)[2]。目前研究證實在一些自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展中DC發(fā)揮了一定的作用。DC可以通過分泌各種具有功能效應的細胞因子，并誘導T細胞激活和分化。DC的微生物識別功能主要依賴于表達在其表面I型跨膜蛋白Toll樣受體(TLR)。TLRs可識別多種多樣的微生物分子結構，如細胞壁成分、核酸以及微生物合成的化合物[3]。表達在DC表面的TLRs，在調節(jié)DC的分化成熟、分泌各種免疫調節(jié)細胞因子、激活初始型T細胞，以及啟動免疫應答等方面起著重要的作用[4]。因此，調控DCs表面TLR的表達就可以調節(jié)DC的成熟狀態(tài)和免疫功能，進而影響機體的免疫反應和免疫耐受。

內嗎啡肽 (endomorphins，EMs)于1997 年由美國神經生物學家 Zadina 等首次報道，并根據結構不同，分為1型(endomorphin-1，EM-1)和2型(endomorphin-2，EM-2)。EMs對Mu阿片受體親和力和選擇性遠遠高于其它生物活性肽，被認為是Mu阿片受體的內源性配體[5]。EM顯著的作用是其鎮(zhèn)痛作用，但目前大量證據表明其亦參與機體的免疫調節(jié)[6]。有研究報道，EM-1影響DC的免疫功能和成熟，本實驗旨在觀察EM-1對DC的影響作用是否與DC表面的TLR2和TLR4有關。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗標本 DC培養(yǎng)所用健康人血樣取自本校學生志愿者，年齡18～23歲(平均20歲)。每份標本的采集均征得本人書面同意。

1.1.2 藥品與試劑 DNA MarkerⅠ和總RNA提取試劑(TRIzol) 均購于北京天根公司；焦炭酸二乙酯(DEPC)原液，購于美國Sigma公司；FITC 標記的抗人CD11 抗體購于美國Caltag公司；TLR2、TLR4、β-actin內參引物，購于南京金凱瑞生物科技公司；RNA抽提試劑盒，購于立陶宛Fermentas公司；DNA聚合酶，購于日本TaKaRa公司；瓊脂糖、溴化乙錠(EB)購于美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 人外周血DC誘導培養(yǎng) 抽取健康志愿者的外周靜脈血20 mL，肝素鈉抗凝。PBS等比稀釋，將稀釋后血樣移入淋巴細胞分離液中，進行密度離心(20℃, 2 000 r·min-1, 20 min)，取界面的白膜細胞，用PBS懸浮細胞，離心洗滌2次，再用RPMI 1640液體培養(yǎng)基懸浮細胞，調整細胞濃度為1×1010·L-1，加入24孔板中[7]，37℃、5% CO2孵箱貼壁培養(yǎng)3 h后，棄上清，用RPMI 1640輕洗2遍，貼壁細胞即為單核細胞。懸浮細胞多為淋巴細胞。貼壁的單核細胞加入RPMI 1640完全培養(yǎng)基，采用rhGM-CSF和rhIL-4聯(lián)合刺激(終濃度均為106U·L-1)，37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)3 d后，輕輕吸棄未貼壁細胞，補充等量細胞因子和新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至6 d，分組加入脂多糖(LPS，100 μg·L-1)或EM-1(1×10-6mol·L-1)刺激,刺激48 h后，收集細胞即為正常人外周血來源的DC。

1.2.2 實驗分組 在細胞培養(yǎng)d 6，將細胞分成4組，BLA組：空白對照組，培養(yǎng)過程中不加LPS及EM-1；EM-1組：培養(yǎng)d 6加入EM-1；LPS組：LPS實驗對照組(培養(yǎng)d 6加入LPS)；LPS+EM-1組：培養(yǎng)d 6加入LPS和EM-1。在實驗中LPS的用量均為100 μg·L-1，EM-1的用量均為1×10-6mmol·L-1。

DC的鑒定：①形態(tài)：在細胞培養(yǎng)過程中，采用倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)和結構變化。②流式細胞術：將收集的懸浮細胞，調整細胞濃度為1×109·L-1，加入流式管中，再分別加入FITC 標記的抗人CD11 抗體以及同型對照FITC 標記的IgG1，避光染色30 min 后，PBS 洗滌3 次，加入300 μL濃度 20 g·L-1多聚甲醛，運用流式細胞術檢測DC成熟表型，Cellsquest 軟件獲取并分析數據。

1.2.3 流式細胞術檢測EM-1對DC表面TLR2、TLR4表達的影響 收集d 8各組細胞，并用抗CD11c FITC、抗TLR2 PE、抗TLR4 PE熒光標記抗體染色，留取空白管和同型對照管。FACS Calibur流式細胞儀(BD公司)上機檢測，CellQuest軟件和Flow Jo軟件分析數據。

1.2.4 RT-PCR法檢測EM-1對DC中TLR2﹑TLR4 mRNA表達的影響 將相同組的DC細胞加2 mL TRIzol，氯仿混勻，加異丙醇離心，加75%的乙醇(預冷)洗滌RNA沉淀后離心。再加DEPC水溶解， 60℃下孵育10 min助溶。取出2 μL原液置于核酸蛋白測定計算器上，紫外光度儀檢測OD260/OD280值和RNA的濃度。取總RNA移入EP管，加入oligo(dT)18primer,去離子水至12 μL。進行以下反應：65 ℃孵育5 min后置于冰上。依次加入Reaction Buffer、RiboLock RNase inhibitor、10 M Dntp mix。37℃孵育5 min后置于冰上。然后加M-MLV逆轉錄酶 1 μL ，至20 μL，混勻后離心；42℃孵育60 min，最后 70℃、10 min以終止反應。即獲得cDNA，立即進行PCR。引物使用Primer Premier 5.0軟件設計，PubMed BLAST驗證。南京金凱瑞公司生物科技公司合成。各因子及內參照引物序列、產物長度如Tab 1所示。

Tab 1 Primer sequences and PCR amplification product length of β-actin, TLR2 and TLR4 gene

應用瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行電泳分析。將凝膠電泳圖像輸入凝膠分析系統(tǒng)，結果以條帶灰度值表示，并選擇β-actin作為內參，在同樣條件下擴增，其表達與細胞總RNA呈正比，以電泳圖中各組TLR2、TLR4分別與β-actin的條帶灰度值比值作為目的基因表達相對水平，計算目的條帶與內參條帶灰度值之比。

1.3 統(tǒng)計學分析采用單因素方差分析對結果進行統(tǒng)計分析，用SPPS 17.0軟件完成。

2 結果

2.1 細胞形態(tài)學觀察人外周血分離的單核細胞在rhGM-CSF和rhIL-4的聯(lián)合刺激下可分化成未成熟DC，在此過程中，細胞形態(tài)會發(fā)生變化。倒置相差顯微鏡下觀察可見，培養(yǎng)d 3細胞出現毛刺狀突起，隨著培養(yǎng)時間延長，DC體積逐漸增大，在d 6突起數量減少，突起增長，呈長梭形，呈貼壁集落式生長。加入LPS約48 h后，部分細胞呈長梭形、條索狀，部分細胞形態(tài)趨向恢復球形，基本已呈懸浮狀生長。但是與對照組相比，EM-1干預后DC形態(tài)學變化不明顯(Fig 1)。

2.2 流式細胞術鑒定DC流式細胞術檢測培養(yǎng)d 8 DC的表型分子CD11c+細胞率，結果顯示DC純度可高達70%，同時鏡下觀察DC細胞形態(tài)典型，進一步證實了本實驗外周血來源DC體系建立(Fig 2)。

2.3 EM-1對DC Mu受體的影響流式細胞術檢測證實，Mu受體在DC中均有表達，Mu受體在imDC表達較低，并且EM-1干預可引起imDC上的Mu受體表達數目上調，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，在致炎因子LPS作用下，EM-1干預后DC的Mu阿片受體的數目上調明顯(P<0.01)(Tab 2、Fig 3)。

Fig 1 Morphological changes of DC in the induced differentiation process

A：imDC in day 3(400×)；B： imDC in day 6(200×)；C：BLA group DC in day 8(200×)；D：EM-1 group DC in day 8(200×)；E： LPS group DC in day 8(200×)；F： LPS+EM-1 group DC in day 8(200×). Seen under the microscope, with the increased incubation time, the volume of DC increased, the number of projections reduced in the day 6, the length of projections increased. After added LPS approximately 48 h, some cells expressed as fusiform, cords, partially restored cell morphology. However, compared with the control group, the DC morphology did not change significantly in EM-1 group.

GroupMureceptorBLA2.62±0.91EM-16.70±1.23LPS33.67±2.77LPS+EM-152.24±3.46##

##P<0.01vsLPS

2.4 流式細胞術檢測EM-1對DC表面TLR2、TLR4表達的影響結果顯示，TLR2、TLR 4在imDC表面表達較高，隨著DC成熟表達下降。與BLA組相比，EM-1組DC上的TLR2、TLR4表達下調(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+EM-1組DC表面TLR2、TLR4受體均明顯下調(P<0.01)，見Tab 3。

GroupTLR2TLR4BLA79.50±4.6058.86±2.40EM-168.92±4.80*49.67±2.12*LPS41.18±3.9926.87±3.28LPS+EM-110.94±1.98##10.65±2.40##F354.924428.521P0.0000.000

*P<0.05vsBLA；##P<0.01vsLPS

2.5 EM-1誘導對DC表面TLR2 mRNA﹑TLR4 mRNA表達的影響RT-PCR結果顯示，與BLA組相比，EM-1干預后引起DC TLR2 mRNA表達明顯降低(P<0.01)，TLR4 mRNA的變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與LPS組相比，LPS+EM-1組 DC上TLR2 mRNA、TLR4 mRNA均有所下調(P<0.05)，見Fig 4。

3 討論

DC是免疫系統(tǒng)中功能最強的抗原提呈細胞，可以激活初始T細胞，具有激發(fā)免疫應答和誘導免疫耐受的雙重作用[8-9]。DC在成熟過程中分為前體、未成熟、成熟3個階段，不同階段抗原提呈能力有所不同。未成熟階段具有強大抗原攝取能力，但因細胞表面協(xié)同刺激因子低表達，誘導T細胞能力較弱。成熟DC表面MHC-Ⅱ分子和協(xié)同刺激分子表達增加，抗原提呈能力增強，對T細胞的誘導能力亦明顯增加，啟動免疫應答。

Fig 2 Purity of DC detected by flow cytometry

A: Dot plot of DC; B: Dot plot of CD11c+ DC; C: Histogram of CD11c+ DC

Fig 3 Expression of Mu receptor on DC surface A: BLA group；B: EM-1 group；C: LPS group；D: LPS+EM-1 group

Fig 4 Expressions of TLR2 mRNA (A) and TLR4 mRNA (B) in DC

有研究表明，μ阿片受體(μ-opioid receptor,MOR)在多種免疫細胞表面表達，可以介導阿片肽對免疫細胞的作用。DC作為功能最強大的APC，亦有MOR的表達[10]。本實驗研究證實，Mu受體在DC中均有表達，在致炎因子LPS作用下，EM-1干預后DC的Mu阿片受體的數目上調明顯(P<0.01)，與相關研究結果相符[11]。EM-1對Mu阿片受體親和力和選擇性遠高于其它生物活性肽，不僅參與炎癥反應，還可通過改變細胞因子的產生對APC進行調控，這種調控方式可能通過抑制DC的趨化性進而抑制DC對T淋巴細胞的激活作用[12]。另有文獻顯示，在大鼠誘發(fā)性關節(jié)炎模型中，炎癥爪局部組織和淋巴結及分泌的滑液中，均發(fā)現 EMs的水平有所升高，同時伴有MOR的高表達[13-14]。本研究中心前期相關研究證實，經LPS及EM-1刺激后小鼠DC表面MHC表達增加[12]，那么EM-1是否還可以通過其他途徑來調控DC的免疫作用呢？本實驗針對研究較多的DC表面的TLR進行研究。TLR是DC和其他免疫細胞識別病原微生物特征的傳感器，能夠與病毒DNA或細菌細胞壁成分(如LPS)等結合，激活免疫系統(tǒng)的第一道防線，即先天性免疫應答，引起炎癥；由TLR途徑產生的先天性免疫信號經由DC繼而引發(fā)以T和B淋巴細胞反應為主的獲得性免疫應答，其在啟動和調節(jié)天然免疫及誘導獲得性免疫中起到重要作用[15-16]。本文結果顯示，TLR2、TLR4在imDC表面表達較高，隨著DC的成熟其表達下降。并且與BLA組(imDC組)相比，EM-1干預可引起DC上的TLR2、 TLR4表達下調；EM-1和LPS共培養(yǎng)，使DC表面TLR2、TLR4受體明顯下調。RT-PCR結果顯示，與Blank組相比，EM-1的干預可引起DC表面 TLR2 mRNA表達降低，而TLR4 mRNA的變化差異無統(tǒng)計學意義；與LPS組相比，LPS+EM-1組 DC上的TLR2 mRNA、TLR4 mRNA均有所下調，提示EM-1能下調DC 表面TLR2、TLR4的表達。TLRs是天然免疫和獲得性免疫的橋梁，可激活機體的天然免疫和獲得性免疫。表達于DC表面上的TLR2和TLR4參與了DC分化成熟的調節(jié)，TLR2和TLR4活化后可經過信號轉導途徑促進DC的分化成熟，并釋放細胞因子調節(jié)T細胞的分化。因此，抑制DC表達TLR2和TLR4可能會在一定程度上阻斷或減少它們對DC的活化作用，從而達到抑制DC的抗原提呈作用。

綜上所述，本實驗發(fā)現EM-1下調DC表面TLR2、TLR4的表達，提示EM-1可能通過抑制DC表面TLR的表達，阻斷了TLR信號轉導途徑介導的DC的成熟和細胞因子的分泌。

[1] Steinman R M,Cohn Z A. Identification of novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice: morphology, quantification,tissue distribution [J].JExpMed, 1973, 137(5): 1142-62.

[2] Ibrahim M A, Chain B M, Katz D R. The injured cell: the role of the dendritic cell system as a sentinel receptor pathway [J].ImmunolToday, 1995, 16(4): 181-6.

[3] Sandor F,Buc M.Toll-like receptors.I.Structure,function and their ligands[J].FoliaBiol(Praha),2005,51(5):148-57.

[4] Akira S，Takeda K，Kaisho T. Toll-like receptors: critical proteins linking innate and acquired immunity[J].NatImmunol, 2001,2(8):675-80.

[5] 李小莉,牛 樂,呂伯昌，等.大鼠內嗎啡肽2和μ阿片受體參與內臟感覺和運動調控的形態(tài)學證據[J].神經解剖學雜志,2010,26(3):233-8.

[5] Li X L,Niu L,Lü B C,et al. Morphological evidence for endomorphine 2 and μ opioid receptor involved in modulation of visceral sensation and movement in the rat[J].ChinJNeuroanat, 2010, 26(3):233-8.

[6] Borner C, Stumm R, Hollt V, et al. Comparative analysis of mu-opioid receptor expression in immune and neuronal cells[J].JNeuroimmunol, 2007, 188(1-2):56-63.

[7] 王 婧,蘇良香,朱天峰. 子癇前期患者外周血樹突狀細胞對Th1 /Th17 細胞分化的影響[J]. 細胞與分子免疫學雜志,2013，29(7)：744-7.

[7] Wang J,Su L X,Zhu T F. Effect of dendritic cells on the differentiation of Th1/Th17 in peripheral blood from preeclampsia patients[J].ChinJCellMolImmunol, 2013，29(7)：744-7.

[8] Soncin F,Mattot V,Lionnetong F, et al.VE-statin,an endothelial repressor of smooth muscles cell migration[J].EMBOJ,2003，22(21):5700-11.

[9] Park L H,Schmidt M,Jin S W, et al.The endothelial-cell-derived secreted factor EGFL7 regulates vescular tube formation[J].Natrue, 2004，428(6984):754-8.

[10]Makarenkova V P, Esche C, Kost N V, et al. Identification of delta-and mu-type opioid receptors on human and murine dendritic cells[J].JNeuroimmunol, 2001,117(1-2):68-77.

[11] Kraus J,Borner C,Giannini E,et al. The role of nuclear factor kappaB in tumor necrosis factor-regulated transcription of the human mu-opiod receptor gene[J].MolPharmacol,2003,64(4):876-84.

[12] 李正紅,于 影,楊 銳，等.內嗎啡肽對小鼠樹突狀細胞免疫功能的影響[J].中國藥理學通報,2011,27(7):939-43.

[12] Li Z H,Yu Y,Yang R, et al. Effect of endomorphins on immunologic function of mouse bone marrow-derived dendritic cells[J].ChinPharmacolBull, 2011,27(7):939-43.

[13] Mousa S A, Machelska H, Schafer M, et al. Immunohistochemical localization of endomorphin-1 and endomorphin-2 in immune cells and spinal cord in a model of inflammatory pain[J].JNeuroimmunol, 2002,126(1-2): 5-15.

[14] Jessop D S, Richards L J, Harbuz M S. Opioid peptides endomorphin-1 and endomorphin-2 in the immune system in humans and in a rodent model of inflammation[J].AnnNYAcadSci, 2002, 966:456-63.

[15] Thornton C A, Morgan G. Innate and adaptive immune pathways to tolerance [J].NestleNutrWorkshopSerPediatrProgram,2009, 64:45-57.

[16] Takeda K, Kaisho T, Akira S. Toll-like receptors[J].AnnuRevImmunol,2003,21(4):335-76．

Effect of endomorphin-1 on TLR2 and TLR4 expressions of dendritic cells from human blood

YANG Li-juan1,PAN Zhi-yu1,CHEN Yong2,TAO Zhi-yong2,XIA Hui2,LI Zheng-hong1

(1.DeptofPhysiology,2.DeptofInfectionandImmunityKeyLaboratoryofAnhuiProvince,BengbuMedicalCollege,BengbuAnhui230030,China)

Aim To observe the effect of endomorphin-1(EM-1) on TLR2 and TLR4 expressions of dendritic cells (DC) from human peripheral blood. Methods Monocytes isolated from human peripheral blood mononuclear cells were cultured in medium containing recombinant human interleukin-4 and recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor. After six days of culture, the immature dendritic cells (imDC) were divided into four groups, the control group (BLA group), EM-1 group, LPS group and LPS + EM-1 group. After 2 days of culture, the expressions of TLR2 and TLR4 were determined by fluorescence activated cell sorter(FACS). The expressions of TLR2 and TLR4 at mRNA level in DC were detected by RT-PCR. Results The FACS results showed that the expressions of TLR2 and TLR4 in imDC were higher, and their expressions were decreased with the maturation of DC. Compared with BLA group, the expressions of TLR2 and TLR4 in DC were down-regulated in EM-1 group (P<0.05).Compared with LPS group, TLR2, TLR4 on DC surface were significantly lower in LPS+EM-1 group (P<0.01). RT-PCR results showed that compared with BLA group, EM-1 intervention induced TLR2 mRNA expression was down-regulated significantly (P<0.01), there were no significant changes of TLR4 mRNA expression (P>0.05). mRNA expressions of TLR2 and TLR4 on DC in LPS+EM-1 group were lower than those in LPS group (P<0.05). Conclusions EM-1 enables the down-regulation of the expressions of TLR2 and TLR4 on DC surface, the effects of EM-1 on immune function may be associated with TLR2 and TLR4 expressions on DC surface.

endomorphin-1; dendritic cells; TLR2; TLR4; immune function;APC

時間：2015-4-15 15:44 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150415.1545.023.html

2015-02-24,

2015-03-27

安徽省教育廳自然科學研究重點項目(No KJ2011A202);蚌埠醫(yī)學院科技發(fā)展基金重點項目(No Bykf13A10)

楊麗娟(1977-)，女，碩士，講師，研究方向：神經生理學，E-mail:bbmeylj@163.com; 潘治宇(1983-)，女，碩士生，研究方向：免疫性疾病的發(fā)病機制，共同第一作者，E-mail:panzhiyu969@sohu.com； 李正紅(1970-)，女，博士，教授，碩士生導師，研究方向：神經生理學，通訊作者,E-mail: lizhbbmc@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.05.022

A

1001-1978(2015)05-0704-05

R329.24；R341.6；R392.11