柞蠶絲素/聚乳酸納米纖維紗的制備及其生物學性能

韓啟明， 何建新， 譚衛琳， 余志才， 邵偉力

(1. 中原工學院 河南省功能性紡織材料重點實驗室， 河南 鄭州 450007； 2. 中原工學院 紡織服裝產業河南省協同創新中心, 河南 鄭州 450007； 3. 天津工業大學 紡織學院， 天津 300387)

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柞蠶絲素/聚乳酸納米纖維紗的制備及其生物學性能

韓啟明1,2， 何建新1,2， 譚衛琳1,2， 余志才1,2， 邵偉力3

(1. 中原工學院 河南省功能性紡織材料重點實驗室， 河南 鄭州 450007； 2. 中原工學院 紡織服裝產業河南省協同創新中心, 河南 鄭州 450007； 3. 天津工業大學 紡織學院， 天津 300387)

為制備力學性能、可加工性、生物學性能良好的骨組織支架材料，利用雙重共軛靜電紡絲裝置制備了4種不同成分比例的柞蠶絲素(TSF)/聚乳酸(PLA)納米纖維紗線。分別通過SEM、紅外光譜和細胞體外培養表征了紗線的形態、二次結構和生物學性能。結果表明：TSF質量分數為10%時，成紗條干均勻，毛羽較少，紗線中纖維直徑較細，力學性能有所改善。細胞在體外培養不同時間后，TSF 質量分數為10%的復合納米纖維紗(PLTF)支架材料上的細胞具有較好的細胞形態和較多的細胞數量，因此PLTF支架材料能夠作為合適的支架用于骨組織工程。

柞蠶絲素； 聚乳酸； 靜電紡； 納米纖維紗； 生物學性能

組織工程學是一門新興學科，主要研究人體組織和器官的修復或構建，涉及細胞生物學、工程學以及材料學[1-2]等學科。利用靜電紡絲方法制備的基于納米纖維的仿生支架材料在組織工程中作為替代材料具有較大的潛力，因為相比較于宏觀、微觀支架材料，靜電紡絲納米纖維支架材料較大的比表面積，高孔隙率以及納米尺特性提供了更好的細胞與仿生材料界面環境[3-4]。目前用于制備基于納米纖維的仿生支架材料中的納米纖維結構大都為不同類型的纖維氈，力學性能差，難以重復加工。如果能利用靜電紡絲的方法紡出納米纖維紗線[5]，纖維將沿著紗的軸向平行排列，相對于纖維氈具有較好的力學性能，而且可利用機織或針織技術加工成不同形式的結構材料。絲素蛋白是具有生物活性的天然高分子材料[6]，尤其是柞蠶絲素蛋白具有豐富的丙氨酸殘基和Arg-Gly-Asp三肽序列，這種序列可用作生物識別，有利于細胞的黏附、增殖，使得TSF更適合生物學應用[7-8]。PLA具有較好的生物相容性，在體內可降解成乳酸，同時其具有較好的靜電可紡性[9]。在骨生長修復過程中，成骨細胞是主要的組織形成細胞，目前已經建立了多種成骨細胞實驗模型用于體外研究，常用的有MG-63、MC-3T3、原代培養的成骨細胞等[10-12]。

本文通過自行搭建對稱四噴頭的高壓靜電紡納米纖維紗裝置制備出柞蠶絲素(TSF)和聚乳酸(PLA)不同成分比例的復合納米纖維紗，為骨組織工程提供了具有一定力學性能和良好生物性能的支架材料。

1 實驗部分

1.1 原材料

柞蠶蠶繭，聚乳酸 (PLA，重均相對分子質量10 000)；人成骨肉瘤細胞(MG-63細胞)，購自中國國家實驗細胞資源共享平臺；聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，若丹明-毒傘素，四甲基偶氮唑藍(MTT)細胞增殖檢測試劑盒，購自 Sigma 公司；使用的其他試劑均為分析純，不需要提純。

1.2 制備不同TSF質量分數的紡絲溶液

用0.5%的碳酸鈉溶液在98 ℃對柞蠶蠶繭煮練脫膠處理3次，每次35 min。在50 ℃用硫氰酸鋰溶液將脫膠后的柞蠶絲溶解2 h 得到絲素粗溶液，然后將過濾后的絲素粗溶液倒入透析袋(截流相對分子質量為8 000～14 000)中透析3 d。將透析后的柞蠶絲素稀溶液在無菌室中室溫下鼓風濃縮至溶液的質量分數為10%后，放入冰箱冷藏一晚后用冷凍干燥機干燥。按照紡絲溶液質量分數為8%的配比，分別稱取TSF和PLA加入六氟異丙醇中，在通風櫥中室溫下磁力攪拌1周，得到紡絲溶液。

1.3 制備不同TSF質量分數的納米纖維紗

按照圖1所示復合納米紗制備裝置示意圖搭建靜電紡絲裝置，以制備TSF和PLA不同成分比例的納米纖維紗。兩端的注射泵將紡絲溶液勻速地輸送到各噴頭，開啟高壓發生器后在正、負間形成高壓電場，噴頭頭端的溶液液滴在高壓電場作用下首先形成泰勒錐，在電場力的進一步作用下分散形成多股射流，直到細化為納米纖維集聚到旋轉的金屬喇叭口邊緣，絕緣棒在喇叭口中心開始牽引纖維，先形成倒錐形的纖維網，隨后成紗卷繞到旋轉卷繞輥上勻速收集紗線。紡絲電壓為18 kV，紡絲溶液總流量為0.9 mL/h(正、負噴頭流量比2∶1)，正負噴頭間距為17.5 cm，噴頭內徑為0.5 mm，金屬喇叭轉速為100 r/min，紗線收集速度為53 mm/min。

圖1 TSF/PLA復合納米紗制備裝置示意圖Fig.1 Preparation device schematic diagram of TSF/PLA composite nanofiber yarns

1.4 紡絲液的特性測試

使用DDS-11A型電導率儀和NDJ-8S旋轉黏度計對不同種類的溶液進行測試。每種溶液測試5次，取其平均值。

1.5 纖維紗表面形貌觀察

采用 JSM-6360 型電子掃描顯微鏡觀察復合納米纖維紗表面形貌。測試前樣品進行鍍金處理，加速電壓為15 kV。

1.6 紅外光譜測試

使用NEXUS670型紅外-拉曼光譜儀對不同TSF質量分數的復合納米纖維紗進行紅外光譜分析。測試條件為：室溫20～25 ℃，相對濕度60%以下，分辨率2 cm-1，每個樣品掃描10次。

1.7 力學性能測試

利用SmileView軟件對不同的復合納米纖維紗線的SEM照片進行處理得到紗線平均直徑。用Instron3365電子強力儀測試不同種類的TSF/PLA納米纖維紗的拉伸性能。每種紗線測試前需重置紗線直徑參數，所有紗線均在夾持長度10 mm，拉伸速度10 mm/min以及初始張力為0.2 cN的條件下進行。每種紗線樣品重復測定10次，取其平均值。

1.8 細胞生長情況分析

對培養1、4 d后的細胞支架材料進行熒光染色分析，先用多聚甲醛固定細胞，Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)溶液處理細胞以獲得通透性細胞，然后用若丹明-毒傘素和DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)分別對細胞膜、基質和細胞核進行染色。最后在熒光顯微鏡(尼康E200)下觀察。

1.9 細胞增殖活性分析

在預定培養天數(1、4和7 d)后，將MG-63細胞培養在含有MTT(5 mg/mL)的檢測試劑盒中，在37 ℃下繼續培養 4 h。終止培養并去除上清液，每孔添加420 μL DMSO振蕩10 min，各孔移取100 μL溶液至96 孔平底培養板，在酶聯免疫檢測儀上選擇492 nm 波長測定各孔吸光度值。

1.10 實驗數據的分析處理

采用SPSS13.0統計軟件對實驗數據進行統計分析處理，以監測數據的可靠性，每組內采集的多個數據使用重復測量方差法進行分析，組間的數據比較分析采用t檢驗，當p<0.05時獲得的分析值被認為可靠，具有統計學意義。

2 實驗結果與討論

2.1 TSF/PLA復合納米纖維紗的形貌

由相同的紡紗條件制備的不同質量比的TSF和PLA復合納米纖維紗的SEM照片如圖2所示?？煽闯?，純的TSF因較差的力學性能難以連續成紗，而純的PLA顯示了較好的可紡性。圖3示出不同TSF質量分數紡絲溶液的黏度和電導率。如圖所示，質量分數為8%的PLA純溶液具有較高的黏度，而電導率較低。純的PLA納米纖維紗具有均勻的捻回分布，納米纖維紗中纖維幾乎沿捻向平行排列，但是納米纖維的直徑較大，約1 000 nm，相應的納米纖維紗也具有較粗的直徑(130 μm)。

注：內嵌圖像放大倍數為6 000。圖2 不同TSF質量分數的復合納米纖維紗的SEM圖片(×500)Fig.2 SEM images of composite nanofiber yarns with different TSF mass fraction (×500)

圖3 不同TSF質量分數的紡絲溶液的黏度/電導率圖Fig.3 Viscosity/conductivity images of spinning solution with different TSF mass fraction

當TSF質量分數為10%時，紡絲溶液黏度迅速降低，而電導率有所增加，纖維成紗直徑顯著降低至500 nm，并且成紗的條干顯著改善(70 μm)，毛羽減少。這是因為柞蠶絲素蛋白大分子的側基上含有很多的極性基團，這些側基在電場中產生電荷增加了紡絲溶液的導電率，另外與PLA大分子的相互作用降低了紡絲溶液的黏度，從而紡絲溶液的射流在更強的電場力作用下能得到更加充分的拉伸。

當TSF的質量分數超過15%后，紡絲液的電導率急劇增加，而黏度幾乎保持穩定。在紡絲過程中，纖維不能穩定地在喇叭口上集束，牽引出的紗線條干顯著惡化，表面毛羽顯著增多，而納米纖維紗中纖維的直徑分布呈現兩極化趨勢。其原因是隨著電導率的增加，同極射流間的排斥產生了大量的飛花，增加了纖維在喇叭口邊緣的集聚難度。

2.2 紅外光譜分析

TSF/PLA復合納米纖維紗的紅外光譜如圖4所示。純PLA納米纖維紗在1 759、1 456、1 387、1 269和1 182 cm-1處有特征吸收峰。添加TSF后，復合纖維紗的紅外吸收光譜圖在1 654、1 544、1 517、1 261和1 229 cm-1處出現了柞蠶絲素蛋白的吸收峰，其中歸屬于α螺旋和無規卷曲的吸收峰(1 654 和1 544 cm-1)較強，歸屬于β折疊的吸收峰(1 517和1 230 cm-1)較弱。隨著TSF質量分數的增大，柞蠶絲素蛋白歸屬于α螺旋、無規卷曲的吸收峰強度明顯增強，而在1 230 cm-1處歸屬于β折疊的吸收峰逐漸被覆蓋，這說明在TSF/PLA復合納米纖維紗中TSF以α螺旋、無規卷曲和β折疊結構共存，其中主要的構象是α螺旋和無規卷曲。這是因為射流從針頭射出后形成的纖維在極短時間內集聚成束，絲素大分子沒有足夠時間調整構象。

圖4 不同TSF質量分數復合納米紗線的紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectra of composite nanofiber yarns with different TSF mass fraction

2.3 力學性能分析

在相同紡紗條件下，不同成分比例的紡絲溶液制得的TSF/PLA復合納米紗線的應力-應變曲線如圖5所示。純的PLA顯示了較好的力學性能，添加少量TSF對紗線的力學性能影響不大，但當TSF含量超過15%以后，納米纖維紗的力學性能顯著下降，這可能是由于紡絲溶液發生相分離，脆性的TSF破壞了纖維中PLA大分子相的連續性。另外，惡化的紗線條干也使得紗線的力學性能下降。

圖5 不同TSF質量分數的復合納米纖維紗的應力-應變曲線Fig.5 Stree-strain curve of composite nanofiber yarns with different TSF mass fraction

2.4 生物學性能分析

細胞的黏附、擴散和增殖是評價特定骨材料細胞相容性和適應性的重要參數。本文實驗選取了力學性能較好的2種納米纖維紗支架材料，通過形態學觀察、MTT法檢測細胞在材料表面早期的黏附、增殖，評價了納米纖維紗支架材料的生物學性能。圖6示出M9-63細胞在純PLA和PLTF支架材料上培養不同天數后的熒光顯微鏡照片。

在培養1 d和4 d 后對細胞進行染色處理，蓋玻片上生長的細胞作為對照組。培養1 d后熒光圖像顯示MG-63細胞在PLTF(絲素質量分數為10%的紗線)支架材料上具有良好的黏附和增殖性，細胞伸展充分，形狀規整，可清晰地觀察到細胞的纖維肌動蛋白和絲狀偽足。MG-63細胞在蓋玻片和PLA(純的PLA紗線)支架材料上的細胞數量相當但明顯低于PLTF支架材料。培養到第4天，PLTF支架材料上的MG-63細胞已經開始出現緊密排列，相互黏連。而PLA支架材料上大部分MG-63細胞分散分布呈現單細胞形態。總的來說，圖6中的結果顯示，接種在PLTF支架材料表面成骨細胞的蔓延，移動和伸展相較于其他支架材料上的細胞要更快一些，結果表明PLTF支架具有更好的能力以促進細胞在體外的增殖。

培養在不同支架材料上的MG-63細胞的MTT數據如圖7所示。

由圖7可看出，培養1 d后，所有支架材料的OD(吸光度)值沒有顯著差異(p>0.05)，培養4 d和7 d以后，MG-63細胞在PLTF上的增殖活性明顯高于對照組和PLA支架(p<0.05)，表明PLTF支架材料中TSF的添加能夠極大地促進MG-63細胞的增殖。有趣的是，在PLA支架材料上培養的MG-63細胞增殖活性一直很緩慢，只有在第7天才顯著增加，但均低于PLTF和對照組支架材料，產生的這種差異可能是由于PLA支架材料表面的極性基團較少不利于細胞的黏附與增殖。

圖6 MG-63細胞在純PLA和PLTF支架材料上培養不同天數后的熒光顯微鏡照片Fig.6 Fluorescence microscope images of MG-63 cells cultivated on pure PLA and PLTF scaffold after different days. (a) Coverslip-1 day; (b) Coverslip- 4 day; (c) Pure PLA-1 day; (d) Pure PLA- 4 day; (e) PLTF-1 day;(f) PLTF- 4 day

圖7 通過MTT分析MG-63細胞在不同支架材料表面增殖情況的直方圖Fig.7 Histogram of MG-63 cells proliferation on different scaffold surface by MTT assay

3 結 論

本文實驗通過靜電紡絲方法制備了類似于骨中高度取向膠原的柞蠶絲素/聚乳酸PLA/TSF混合納米纖維紗。研究了不同絲素質量分數靜電紡紗線的形態和力學性能。加入少量柞蠶絲素，復合納米纖維紗和紗中纖維的直徑都有明顯降低，其中紗線的直徑由130 μm降至70 μm，纖維的直徑由1 000 nm降至500 nm，紗線的形貌和力學性能明顯獲得了優化。當TSF質量分數超過15%后，紡絲溶液開始出現分離，同種紗線中納米纖維呈現2種分布差異，一部分纖維平均直徑500 nm，另一部分平均直徑1 000 nm?？偟膩碚f，柞蠶絲素含量為10%的TSF/PLA復合納米纖維紗具有較細的纖維直徑(500 nm)，均勻的紗線細度(70 μm)和較好的力學性能(37.58 MPa)。生物相容性分析也證明了質量分數為10%的TSF靜電紡納米紗線支架材料相比于純的PLA支架材料能提供更好的微觀環境以仿生自然細胞外基質，可作為理想的骨組織工程支架材料。

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Preparation and biological properties of tussah fibroin/polylactic acid nanofiber yarns

HAN Qiming1,2， HE Jianxin1,2， TAN Weilin1,2， YU Zhicai1,2， SHAO Weili3
(1.HenanKeyLaboratoryofTextileMaterials,ZhongyuanUniversityofTechnology,Zhengzhou,Henan450007,China; 2.TextileandApparelIndustryCollaborativeInnovationCenterofHenan,ZhongyuanUniversityofTechnology,Zhengzhou,Henan450007,China; 3.SchoolofTextiles,TianjinPolytechnicUniversity,Tianjin300387,China)

Tussah fibroin (TSF)/polylactic acid (PLA) composite nanofiber yarns with different ratios of TSF to PLA were prepared to fabricate tissue scaffold with great mechanical properties, good processability and biological properties by a double conjugation static-spinning device. The scanning electronic microscopy (SEM) and infrared spectroscopy (FT-IR) and cell culture in vitro were used to characterize the morphology, secondary structure and biological properties of the yarns separately. The result indicates that the yarn with the ratio of TSF to PLA of 1∶9 gains smaller diameter, uniform evenness as well as less hairiness and better mechanical. After being cultured in vitro for different time, the yarn with the ratio of TSF to PLA of 1∶9 as tissue scaffold keep healthy and more cell counts to make the PLTF yarn suitable as appropriate scaffold for bone tissue engineering.

tussah fibroin; polylactic acid; electrostatic spinning; nanofiber yarn; biological property

10.13475/j.fzxb.20141007806

2014-10-29

2015-06-16

國家自然科學基金項目(51203196)；NSFC-河南人才培養聯合基金項目(U1204510)；河南省教育廳科學技術研究重點項目(14A540003，14A540006)；鄭州市普通科技攻關項目(141PPTGG400)

韓啟明(1989—)，女，碩士生。主要研究方向為納米生物材料。何建新，通信作者， E-mail：hejianxin 771117@163.com。

TS 102.1

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