4種阿爾茨海默病動物模型行為學改變及凋亡機制的比較

侯雪芹 張 磊 林雅萍 田會娟 張春霞 劉 玉 楊 從 王 奇 陳云波 程淑意 方淑環

(廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405)

·基礎研究·

4種阿爾茨海默病動物模型行為學改變及凋亡機制的比較

侯雪芹 張 磊 林雅萍 田會娟 張春霞 劉 玉 楊 從 王 奇 陳云波 程淑意 方淑環

(廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405)

目的 探討4種常見阿爾茨海默病(AD)動物模型在研究凋亡機制領域中的優勢。方法 采用4種常見AD模型(東莨菪堿致記憶障礙模型、鵝膏蕈酸致癡呆大鼠模型、快速老化模型、雙轉基因小鼠模型)，利用Morris水迷宮測試動物模型認知能力；免疫印跡檢測Bcl-2蛋白表達水平；TUNEL染色檢測凋亡水平。結果 在凋亡機制研究探討中，快速老化小鼠(SAM)在Morris水迷宮測試、Bcl-2蛋白表達以及凋亡檢測中其正常組與模型組均有顯著差異(P<0.05)。結論 SAM模型在老年癡呆凋亡機制中有明顯優勢，為中藥治療老年癡呆的臨床前研究提供指導。

老年癡呆模型；Morris水迷宮；免疫印跡；免疫組化

阿爾茨海默病(AD)是一種與年齡相關的中樞神經系統退行性病變，病因不明、發病機制復雜〔1〕。大量的研究表明，在AD發病過程中，細胞凋亡起主導作用，由于細胞凋亡的機制涉及一系列基因的復雜調控，因此在不同的細胞，凋亡調節也存在差異〔2，3〕。Bcl-2通過抑制多種形式的細胞凋亡延長細胞生命，導致細胞數目增加。本研究通過檢測4種常見AD動物模型的學習記憶能力及Bcl-2蛋白表達水平，比較凋亡機制研究中的優勢與不足，篩選出最佳的研究凋亡機制的AD模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 昆明種小鼠，5月齡SPF級，雄性，體重(25±2)g，來源于廣州中醫藥大學實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK(蘇)2011-0029。 5月齡SPF級SD大鼠，雌性，平均體重200～250 g，來源于廣州中醫藥大學實驗動物中心，動物質量合格證號：0080828。快速老化小鼠(SAM)P8，5月齡SPF級，雄性，體重(25±5)g，由北京大學醫學部實驗動物科學部提供，許可證號：SCXK(京)2006-0008，動物質量合格證號：0201360。APPswe/PS1dE9轉基因小鼠，5月齡，SPF級，全雄性，體重(30±5)g，由南京大學模式動物研究所提供，實驗動物許可證號：SCXK(蘇)2010-0001，動物質量合格證號：2010625。

以上動物均飼養于廣州中醫藥大學(三元里)校區實驗動物中心SPF級動物房，單籠飼養，自由飲食自然照明。

1.1.2 試劑 氫溴酸東莨菪堿注射液，批號H44020567；鵝膏蕈酸(IBO)，Sigma，批號：28K38091V；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，碧云天生物公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒，碧波生物科技有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜，廣州生物友田科技公司提供。Trisbase、過硫酸胺(APS)、甘氨酸均為Bio-rad產品；原位末端標記法(TUNEL)凋亡檢測試劑盒為Roche產品。

1.1.3 儀器 TECAN多功能自動酶標儀；超低溫冰箱：Forma Scientific；高速離心機：貝克曼Microfuge Lite；脫水機：LEICA TP1020；包埋機：LEICA EG1160；切片機：LEICA RM2135；圖像采集與分析儀：LEICA DM4000B顯微鏡與LEICA QWIN plus軟件。微量進樣器，上海安亭微量進樣器廠生產，規格為1 μl；大鼠腦立體定位儀，深圳瑞沃德生命科技公司生產，型號：MP8002，SN：06091714；Morris水迷宮及軟件由中國醫學科學院藥物研究所提供，型號DMS-2。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制 鹽酸多奈哌齊片(治療組藥物)，使用前將片劑研成粉末，以蒸餾水配制成灌胃藥液，配制濃度為0.4 mg/ml。IBO以超純水稀釋，配制成5 μg/μl的IBO注射液。

1.2.2 模型制備

1.2.2.1 東莨菪堿致記憶障礙模型小鼠 參照葉翠飛等〔4〕方法，于每天試驗前(各組腹腔注射給藥30 min后)除正常組腹腔注射等量的生理鹽水外，其余各組小鼠均腹腔注射東莨菪堿1 mg/kg，直到實驗全部結束。

1.2.2.2 IBO致癡呆大鼠模型 大鼠腦立體定位參照包新民等〔5〕方法，先將大鼠用10%水合氯醛0.35 ml/100 g的劑量腹腔注射麻醉，將其固定在腦立體定位儀上，常規消毒大鼠頭部皮膚，在頭部中線處，縱開1.0～2.0 cm左右切口。用10%雙氧水擦拭，直到暴露大鼠前囟點(雙氧水一則使前囟骨縫顯露更清晰，二則消毒，避免厭氧菌感染)。將微量進樣器的針頭對準前囟，抽取1 μl IBO(假手術組以生理鹽水代替)，拔出三棱針，將標尺移回原來所定的點上，向硬膜下移動8.2 mm。單側注射IBO 5 μg，在10 min內注完，盡量保持勻速，留針5 min。留針完后出針，同樣方法對側相同位置注射IBO 5 μg。兩側注藥完畢后，將大鼠從定位儀上取下來，縫合大鼠頭皮，最后用酒精常規消毒傷口。

1.2.3 動物分組和給藥 適應性飼養后，隨機分為正常組、模型組、鹽酸多奈哌齊(陽性藥)組，因造模或其他因素(如灌胃)、死亡等導致每組種子數有所差異，但每組不少于8只。

1.2.4 學習記憶能力測試 使用Morris水迷宮測試軟件，由中國醫學科學院藥物研究所提供。水迷宮由圓形水池、無色平臺和記錄系統3部分組成。水池直徑100 cm，高50 cm，水池內壁涂成黑色，以通過池圓心的兩條垂直交叉線將水池分為西北、東北、東南、西南4個象限，分別定為1、2、3、4象限。平臺置于第4象限，直徑7 cm，高29 cm，平臺邊緣有孔洞以便于小鼠抓牢。水迷宮檢測軟件系統自動跟蹤池內小鼠的活動軌跡并記錄游泳時間、路程、在各象限停留時間和跨平臺次數等項參數。

1.2.5 Western印跡檢測蛋白表達 實驗鼠行為學測試后快速斷頭處死，迅速冰上剝離大腦新鮮組織標本，分別置于EP管中，-80℃儲存備用。將每只實驗鼠的大腦組織用1 ml放射免疫沉淀試驗(RIPA)組織/細胞裂解液、10 μl的苯甲磺酰氟(PMSF)和100 μl磷酸酶抑制劑在冰上進行超聲粉碎、勻漿，然后于4℃，15 000 r/min離心30 min，取上清液，用BCA方法測定其蛋白質的濃度。實驗步驟主要參照馬文麗〔6〕方法進行。應用生物凝膠圖像分析系統(Gene Genius Bioimage analysis system)掃描，采用GeneSnap軟件拍攝圖片，GeneTool軟件進行條帶的灰度值定量分析。用β-actin作為參照，比較各組樣品目的蛋白/內參照蛋白β-actin比值變化。

1.2.6 TUNEL染色檢測細胞凋亡 將大腦組織4%多聚甲醛固定，24 h后進行脫水、石蠟包埋、切片，用TUNEL檢測細胞凋亡。 每張切片選取同一部位先于10×10倍鏡下觀察TUNEL染色情況，再于40×10倍鏡下分別選取3個不重復的視野，使用LEICA QWIN plus圖像分析軟件采集圖像，所有圖像采集時曝光時間及色彩飽和度等參數一致，采用LEICA QWIN plus圖像分析軟件檢測陽性染色，以同一顏色檢測標準計算陽性染色區域面積及陽性染色面積占圖像面積的百分比。以3個視野的平均值代表該張切片的凋亡水平。

1.3 統計學分析 采用SPSS17.0軟件行重復測量方差分析或單因素方差分析。

2 結 果

2.1 Morris水迷宮成績 4種AD動物模型定位航行試驗逃避潛伏期的組間比較結果見表1。

2.2 抑凋亡蛋白Bcl-2表達水平 對于東莨菪堿致記憶障礙模型，模型組較正常組Bcl-2表達下調(P<0.01)，陽性藥組較模型組Bcl-2表達水平升高(P<0.05)。對于IBO致癡呆大鼠模型，模型組較正常組Bcl-2表達下調(P<0.01)，陽性藥組較模型組Bcl-2表達水平升高(P<0.05)。 對于SAMP8，模型組較正常組Bcl-2表達水平低(P<0.05)，陽性藥組Bcl-2表達水平高于模型組(P<0.05)。對于雙轉基因小鼠模型，模型組較正常組Bcl-2蛋白表達明顯減少(P<0.05)，陽性藥組Bcl-2表達水平有高于模型組的趨勢。見表2，圖2。

2.3 TUNEL法檢測細胞凋亡 4種AD動物模型腦組織切片TUNEL染色結果見表3。

表1 4種AD動物模型定位航行試驗逃避潛伏期的組間比較±s,s,n=4)

與正常組(假手術組)比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，下表同

表2 4種AD動物模型腦組織Bcl-2表達水平

表3 4種AD動物模型腦組織細胞凋亡百分率

A～D分別表示東莨菪堿模型小鼠、IBO致癡呆大鼠、SAMP8和APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠；1～3分別表示正常組(假手術組)、模型組、陽性藥組

3 討 論

本文4種模型主要依據AD病因病理研究而成，各有其特點，都在一定的程度上或某些方面模擬了 AD的癥狀和病理改變，各自具有自己的適用范圍和作用，又各有優勢與不足〔7〕。

IBO及東莨菪堿誘導模型雖表現有膽堿能系統功能喪失和學習記憶損害，但無全身衰老的表現〔8〕。轉基因模型僅出現淀粉樣蛋白沉積，影響因素較多〔9〕。目前AD研究的重點已從損毀模型轉移到了自身免疫模型和轉基因模型，建立自身免疫模型和轉基因模型(包括基因剔除模型)對研究AD的發病機制具有重要意義，但目前仍面臨許多問題有待解決。SAM P8是一個較好的AD替代模型，它既有學習記憶功能障礙等衰老的特征，又有明顯的細胞凋亡跡象。SAP8是公認的研究老年癡呆的動物模型，其學習記憶障礙出現較早且自然發生，具有老年癡呆的病理學特征，能很好地模擬AD的學習記憶障礙形成過程。目前已被應用于衰老及AD防治藥物實驗藥理學研究，能夠較好地再現淀粉樣蛋白沉積、老年斑及免疫功能紊亂等AD的一些重要特征，具有較大的實用價值。APPswe/PS1dE9轉基因小鼠是由APPswe 轉基因小鼠和PS1dE9轉基因小鼠進行雜交所得，表型穩定，APP 基因PCR 產物長344 kb ，PS 基因PCR 產物長608 kb。因此，在研究治療老年性癡呆的藥物時，應依據研究機制選擇不同動物品系、為AD治療藥物的研究開發及作用機制探討提供可行的依據，做到全面、系統、合理、科學評價藥物的療效與作用機制，更好地為臨床服務。

1 于天蓮,趙小貞. 阿爾茨海默病動物模型研究概況〔J〕. 醫學綜述,2009;15(18):2726-9.

2 蔡琳琳. 中藥復方有效組分早期干預對APP轉基因小鼠膽堿能系統及腦細胞凋亡的影響〔D〕.北京：中國中醫科學院碩士論文,2010.

3 Pelkey TJ,Frierson HF,Bruns DE. Molecular and immunological detection of circulating tumor cells and micrometastasis from solid tumor〔J〕. Clin Chem，1996;42(9):1369-81.

4 葉翠飛,張 蘭,張 麗,等.牛磺酸對東莨菪堿所致記憶獲得性障礙模型小鼠的改善作用〔J〕.中國藥理學通報,2005;21(6):715-7.

5 包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜〔M〕.北京：人民衛生出版社,1991.

6 馬文麗. 分子生物學實驗手冊〔M〕.北京：人民軍醫出版社,2011:11.

7 趙保勝,徐暾海. 老年性癡呆疾病模型的建立〔J〕. 中國實驗方劑學雜志,2011;17(6):274-6.

8 謝 寧,宋琳莉,牛英才,等. 老年性癡呆動物模型研究進展及其評價〔J〕.實驗動物與比較醫學,2006;26(1):50-3.

9 魏小龍,張永祥. 老年性癡呆動物模型研究進展〔J〕.中國藥理學通報,2000;16(4):372-6.

〔2013-12-23修回〕

(編輯 袁左鳴)

Comparation of behavioristics and mechanism of apoptosis in four kinds of AD animal models

HOU Xue-Qin,ZHANG Lei,LIN Ya-Ping,etal.

Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405,Guangdong,China

Objective To discuss advantages of 4 common AD animal models on research mechanism of apoptosis.Methods Four common AD model-scopolamine dysmnesia model,ibotenic acid dementia model,senescence accelerated model and double transgenic mice model were used. The cognitive competences of animal models were evaluated by Morris water maze. Bcl-12 protein expression was tested by Western blot and apoptosis was measured by immunohistochemistry TUNEL staining.Results The results of Morris water maze test,Bcl-12 protein expression and apoptosis had significant differences of SAM between normal and model groups(P<0.05).Conclusions SAM model has its great advantage in mechanism of apoptosis of AD,so it could offer guidance in preclinical study of treating-AD herbs.

AD animal model;Morris water maze;Western blot;Immunohistochemistry

國家自然科學基金(No.81273817)；高等學校博士學科點專項科研基金(No.201144251100a07)；廣東省重大科技專項(No.2012A080202017)；廣東省科技計劃項目(No.2010A030100009)；廣東省高等學?？萍紕撔马椖?No.2012KJCX0032)

王 奇(1963-)，男，教授，主要從事腦病臨床與實驗研究。

侯雪芹(1985-)，女，博士，主要從事腦病臨床與實驗研究。

R259

A

1005-9202(2015)12-3185-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.001