心腦舒通對大鼠腦缺血再灌注損傷缺血周邊區微血管新生及Ang/Tie系統表達的影響

何前松 楊紅云 胡利民 馬萌萌 張 莉 劉曉雷 鄒兆鵬 王少峽

(天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津 300193)

心腦舒通對大鼠腦缺血再灌注損傷缺血周邊區微血管新生及Ang/Tie系統表達的影響

何前松1楊紅云 胡利民 馬萌萌 張 莉 劉曉雷 鄒兆鵬2王少峽

(天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津 300193)

目的 觀察心腦舒通膠囊對大鼠局灶性腦缺血再灌注(I/R)損傷缺血周邊區腦組織微血管新生及血管生成素(Ang)/酪氨酸激酶受體(Tie)系統表達的影響。方法 隨機分為假手術組、腦I/R損傷模型組、心腦舒通膠囊(14、28、56 mg/kg)組，采用線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)缺血再灌注模型，缺血90 min后再灌注，分別于造模前30 min、缺血6 h、缺血24 h，每日給藥1次,連續7 d。于灌注24 h、7 d后行神經功能評分，末次給藥1 h后用水合氯醛(350 mg/kg)麻醉并斷頭取腦組織，采用Western印跡法測定I/R大鼠皮層缺血周邊區Ang1、Ang2、Tie2表達，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察腦組織微血管形態及血流灌注量。結果 與模型組比較，心腦舒通組大鼠神經功能改善，皮層缺血周邊區微血管的數量較多(P<0.01，P<0.05)，Ang1、Tie2蛋白表達量增多(P<0.01，P<0.05)，Ang2蛋白表達量較少(P<0.05)。結論 心腦舒通可調節大鼠Ang/Tie系統的表達，促進腦缺血后微血管新生，有利于腦缺血后神經功能的恢復。

心腦舒通膠囊；腦缺血再灌注損傷；血管新生；血管生成素；酪氨酸激酶受體-2

腦缺血后，腦組織因局部血流的減少或完全阻斷會引起缺血、缺氧、組織壞死，及時恢復血流灌注成為挽救部分可逆性損傷神經元、減小腦梗死面積、促進神經功能恢復最有效的方法。治療性血管新生可以改善缺血區周圍的組織灌注，增加腦血流量，從而增加受損腦組織的氧供，促進神經系統的恢復。既往研究表明，心腦舒通膠囊(XNST)可有效調控急性腦缺血再灌注病理過程中的血管新生，改善神經細胞、微血管損傷程度,明顯下調血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)mRNA 的高表達〔1，2〕。血管生成素(Ang)及其受體酪氨酸激酶受體(Tie)-2系統對腦缺血后微血管的生成發揮重要作用〔3～5〕。本研究擬探討心腦舒通對腦缺血/再灌注(I/R)損傷微血管新生及Ang/Tie系統表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：健康清潔級Wistar大鼠50只，雄性，體重(260±10)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號:SCXK(京)2012-0001。分籠飼養，自由進食，飼養溫度為22℃～25℃，相對濕度40%～60%。

藥物：心腦舒通膠囊由吉林敖東洮南藥業股份有限公司提供(國藥準字Z22021965)，主要成分為呋甾皂苷。臨用前用蒸餾水溶解，現用現配。

試劑：SP 試劑盒由北京中杉金橋生物技術開發公司提供； Anti-Angiopoietin-1 Antibody(AB10516-millipo，100 μl，Millipore 試劑)；抗Ang2 〔EPR2891(2)〕抗體(ab155106，100 μg，Abcam)；Tie-2(H-176，sc-9026，200 μg/ml，Santa Cruz)。蛋白提取試劑盒和蛋白定量試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。FITC-右旋糖酐(美國Sigma公司，50 mg/ml，分子量2×106)；異氟烷(Isoflurane，怡美寧，山東科源制藥有限公司)；水合氯醛(分析純，天津市瑞金特化學品有限公司)；多聚甲醛純度>95%(天津市光復精細化工研究所)。

1.2 儀器 VT1000 S型振動切片機(德國Leica公司)；LSM710型激光掃描共聚焦顯微鏡(德國ZEISS 公司)；海爾超低溫冰箱；臺式高速冷凍離心機(德國公司Heraeus)。氣體麻醉機(Isoflurane Vaporizer，Matrx)；線栓(A5-2636，北京沙東生物技術有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 局灶性腦I/R模型的制作 根據Longa等〔6〕的方法，建立改良線栓法制作大鼠局灶性I/R模型。大鼠術前禁食12 h，自由飲水，3.5%異氟烷麻醉，仰臥位固定，采用電熱板將體溫維持在(37.0±0.5)℃。備皮，消毒頸部皮膚，頸正中切開，鈍性分離，打開頸動脈鞘，暴露右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)，由CCA分叉處向頭端依次游離，電熱燒灼器燒斷ECA的分支，結扎并游離ECA主干一段，沿ICA向下分離翼顎動脈(PPA)，用眼科動脈夾夾閉CCA、ICA和PCA的近心端。輕拉ECA使之與ICA成近似直線，在ECA近游離端斜剪一“V”形切口，沿ICA插入線栓，用激光多普勒血流儀監測腦血流變化，判斷大腦中動脈是否阻塞成功(以腦血流量降至基礎值30%以下為標準)。腦缺血90 min后再用3.5%氟烷麻醉，將線栓抽出再灌注，結扎ECA以防出血,切口處擦適量慶大霉素防止感染，縫合皮膚。假手術組分離血管不插線栓。

1.3.2 分組與給藥 取50只Wistar大鼠，適應性喂養1 w，隨機分為假手術組、模型組、心腦舒通(14、28、56 mg/kg)組，每組10只。大鼠術前禁食12 h，此后每天灌胃給藥1次，連續7 d，模型組和假手術組給予等體積生理鹽水。

1.3.3 神經功能缺損評分 對灌注后24 h、7 d的大鼠，參考文獻〔7〕,分別進行神經功能缺損評分。0分：無神經功能缺損癥狀；1分：左側前肢屈曲；2分：拉尾時左側前肢抓力下降；3分：無方向性運動，抓尾時向對側轉圈；4分：自發向對側轉圈及意識障礙。

1.3.4 腦血漿灌注量、腦微血管直徑及形態的觀察 參考文獻〔8,9〕方法，用異硫氰酸熒光素(FITC)標記的右旋糖苷標記血漿，在激光掃描共聚焦顯微鏡(LSM710型)下觀察腦血漿灌注量、微血管直徑及形態，缺血再灌注后7 d將動物麻醉，FITC-右旋糖苷1 ml尾靜脈注射，1 min后斷頭，快速取出腦組織，置于4%多聚甲醛中4℃固定48 h，采用振動切片機冠狀切片，取視交叉部位，片厚150 μm。用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，激發波長488 nm，20倍鏡下，x-Y平面采用512×512 像素，2×面平均，2×線平均，觀察皮層缺血半暗帶，Z軸方向每0.5 μm 掃一層，共掃100個層面，獲得圖像體積為(750×750×50)μm3，將所獲得的圖像進行三維重建，用綠色熒光所占體積表示血漿灌注量，觀察血管的數目和形態。

1.3.5 Western印跡檢測皮層缺血周邊區腦組織Ang1、Ang2及Tie2表達 再灌注7 d后，將大鼠用10% 的水合氯醛麻醉，4℃生理鹽水100 ml快速沖洗，立即斷頭并置于冰盒上開顱取腦，取缺血周邊區皮質，錫紙包裹，液氮速凍，然后放于-80℃超低溫冰箱保存備用。采用Western印跡法測定缺血側大腦Ang1、Ang2及Tie2蛋白表達。

1.4 統計學處理 采用SPSS17.0 軟件進行單因素方差分析、LSD法檢驗。

2 結 果

2.1 模型評價 模型制作過程中，采用激光多普勒血流儀監測大鼠大腦中動脈血流變化，大鼠腦血流降于基礎值15%～30%以下。

2.2 神經功能缺損評分 假手術組大鼠行為學正常，神經功能評分0分；模型組神經功能缺損癥狀明顯，神經功能評分明顯增加(P<0.01)；心腦舒通各劑量組神經功能損癥癥狀明顯改善，神經功能評分明顯低于模型組(P<0.01或P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分±s，n=10)

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

2.3 心腦舒通膠囊對腦缺血大鼠微血管形態和血漿灌注量的影響 與假手術組比較，模型組大腦皮層微血管數目少、分支少，走形紊亂、不規則；與模型組比較，心腦舒通大劑量組血管明顯呈迂曲、不規則,微血管分支數目增多。與模型組比較，心腦舒通大、中劑量組腦缺血皮層區微血管的血流灌注量增加,尤其大劑量組能夠顯著促進腦缺血皮層區微血管的血流灌注量。見圖1、表2。

表2 各組大鼠腦血管三維結構定量分析±s，n=4)

2.4 心腦舒通膠囊對腦缺血再灌注損傷大鼠大腦Ang1、Ang2及Tie2表達的影響 結果顯示，心腦舒通各組Ang-1和Tie-2的表達明顯高于模型組，Ang-2的表達則相反。見圖2、表3。

圖2 大鼠腦皮層區微血管形態(×200)

組別Ang1/β?actinAng2/β?actinTie2/β?actin假手術組0 65±0 050 43±0 140 32±0 06模型組0 33±0 080 58±0 150 24±0 04心腦舒通14mg/kg組0 38±0 160 42±0 161)0 26±0 03心腦舒通28mg/kg組0 53±0 072)0 41±0 081)0 32±0 052)心腦舒通56mg/kg組0 54±0 122)0 43±0 121)0 31±0 052)

圖4 各組大鼠缺血周邊區Ang1、Ang2、Tie2蛋白表達的影響

3 討 論

腦缺血再灌注損傷是由于大腦中動脈堵塞，局部腦血流中斷或減少，使血管支配區域失于供氧，進而發生缺血級聯反應，損傷區域局部的新生血管對中樞神經系統損傷后的再生、修復具有極為重要的影響〔10,11〕。因此，臨床治療的最終目標是最大限度地改善腦組織缺血，恢復神經功能缺損。本實驗結果表明,心腦舒通可改善大鼠神經功能缺損、提高存活率，促進微血管生成，其促進血管生成可能與增加大鼠內源性Ang1和Tie2的表達有關。

心腦舒通膠囊是中藥蒺藜科屬植物蒺藜干燥地上全草提取制成的膠囊劑，其主要有效成分是呋甾皂苷，具有活血化瘀、祛痰化濕、宣痹通陽、補益肝腎等功效。臨床研究證實心腦舒通可增加患者腦缺血部位血流量,改善腦循環，能增加腦動脈硬化和腦血栓形成后遺癥患者腦缺血部位的血供,護缺血腦組織〔12，13〕。實驗研究顯示，心腦舒通膠囊可改善微循環和血液流變性、抗血小板聚集、降血脂等功能，對大鼠腦缺血再灌注損傷具有神經細胞保護作用,其機制可能是與抑制腦缺血再灌注后的腦內脂質過氧物反應、降低自由基損傷、減輕神經細胞凋亡有關〔14,15〕。本研究結果顯示心腦舒通能夠增加缺血區血流灌注量，微血管密度，微血管分支數目明顯增多，提示心腦舒通膠囊能夠促進缺血區微血管的新生。

促血管生成素家族在血管生成中起到重要作用,Ang1是Tie2的特異激活劑,Ang1是血管穩定因子，在血管重塑階段參與血管生成，促進血管的穩定成熟,對維持血管完整性及血管成熟有重要作用；Ang2是Ang1的天然拮抗劑,起到抑制Ang1穩定血管的作用〔5,16〕。Ang1及其配體Tie2組成Ang/Tie2 信號通路，Ang/Tie2 通路在維持新生血管完整性、穩定性和促進血管新生方面發揮重要作用,其主要機制：①使血管內皮細胞趨化、聚集，吸引周圍細胞形成新生血管；②拮抗內皮細胞凋亡；③促進血管內皮細胞遷移和形成管狀結構，加強VEGF等的血管穩定作用；④調節內皮細胞和血管平滑肌細胞，促進血管重塑、成熟，維持血管的完整性和穩定性。Ang1對內皮細胞有特異性作用，促進毛細血管分支，在血管的形成、穩定及重建方面扮演重要角色。據報道，腦出血損傷可見血腫周圍的血管新生,大約7 d,新生的血管伸入到血腫,而且在新生血管上可以看見Ang-1/Tie-2的陽性表達〔21〕。本實驗結果提示心腦舒通能促進腦缺血大鼠缺血局部血管的新生及新生血管的穩定、成熟和重塑，為心腦舒通治療缺血性腦血管病提供了理論依據。

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〔2014-09-12修回〕

(編輯 郭 菁)

The effects of Xinnao Shutong capsule on the expressions of Angiopoietin1/Tie2 and angiogenesis after cerebral ischemia-reperfusion injury in rats

HE Qian-Song,YANG Hong-Yun,HU Li-Min,etal.

Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine,Tianjin Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmacology,Tianjin 300193,China

Objective To study the effects of Xinnao Shutong capsule(XNST)on the expressions of Angiopoietin(Ang)1/Tyrosine kinase receptor(Tie)2 and angiogenesis after cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.Methods 50 male Wistar rats were randomly divided into sham operation,model and XNST-treatment(56,28,14 mg/kg)groups. The cerebral ischemic injury was induced by middle cerebral artery occlusion(MCAO). The microvascular morphology and the volume of blood perfusion in the brain tissue were observed under lasers canning confocal microscope(LSCM),and the expression of IBZ was observed. The expressions of Ang1,Tie2 and Ang2 in the ischaemic border were detected using Western blot after 7 days of medication.Results The blood perfusion volumes in the ischemic brain cortex were promoted in middle and large dose XNST groups(P<0.01,P<0.05). XNST-treatment significantly increased Ang1 and Tie2 expressions in the ischaemic border compared to that of MCAO group(P<0.01,P<0.05). XNST also significantly increased to further investigate the signalling pathway of XNST -induced vascular stabilization and angiogenesis.Conclusions XNST up-regulates the Ang1/Tie2 expressions,mediates vascular angiogenesis and stabilization the course of cerebral ischemia-reperfusion injury.

Xinnao Shutong capsule(XNST);Cerebral ischemia-reperfusion injury;Angiogenesis;Angiopoietin;Tyrosine kinase receptor-2

國家科技重大專項項目重大新藥創制(2011ZX09201-201-33)

胡利民(1966-)，男，博士，研究員，主要從事腦血管病藥理研究。

何前松(1979-)，男，在讀博士，副教授，主要從事中醫藥防治腦血管疾病的機制研究。

R743.3

A

1005-9202(2015)12-3203-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.008

1 貴陽中醫學院 2 吉林敖東洮南藥業股份有限公司