蛛網膜下腔出血大鼠基底動脈及血漿eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α的表達變化

吳 雷 郭 華 高子云 胡尚偉 沈曉黎 祝新根

(南昌大學第二附屬醫院神經外科，江西 南昌 330006)

蛛網膜下腔出血大鼠基底動脈及血漿eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α的表達變化

吳 雷 郭 華 高子云 胡尚偉 沈曉黎 祝新根

(南昌大學第二附屬醫院神經外科，江西 南昌 330006)

目的 探討eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α在蛛網膜下腔出血(SAH)后不同時間點基底動脈、血漿表達情況及其與腦血管痙攣的關系。方法 SD大鼠 42只，隨機分成:對照組(n=6)、假注血組(n=18)、SAH 組(n=18)。假注血組及SAH 組進一步按時間隨機分為術后1、7、11 d 3個亞組，每組 6 只。采用枕大池二次注血法建立大鼠 SAH 模型。二次注血后在各個時間點采集實驗動物血液標本,處死動物,取腦組織及基底動脈，測定基底動脈橫截面積判斷有無腦血管痙攣;應用RT-PCR分別觀察eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α在基底動脈中的表達情況;應用ELISA檢測eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α在血漿中的表達情況;原位細胞凋亡檢測法檢測顳葉神經元凋亡情況。結果 枕大池二次注血法成功制作 SAH 模型，基底動脈發生了不同程度的血管痙攣。SAH組與對照組和假注血組相比大鼠基底動脈橫截面積明顯減少。RT-PCR及ELISA觀察到ICAM-1、TN-C和PGF2α在SAH組高表達。而eNOS在SAH組中低表達,第7天表達水平最低。eNOS濃度降低，皮質神經元凋亡指數升高，ICAM-1、TN-C和PGF2α濃度升高，皮質神經元凋亡指數升高。結論 SAH 后eNOS,ICAM-1,TN-C,PGF2α表達水平的變化與腦血管痙攣發展的時相性具有一定的一致性，eNOS,ICAM-1,TN-C,PGF2α可能參與SAH后腦血管痙攣的發生。

蛛網膜下腔出血;eNOS;ICAM-1;TN-C;PGF2α;RT-PCR;腦血管痙攣

腦血管痙攣(CVS)是蛛網膜下腔出血(SAH)最嚴重的并發癥之一，是引起高致殘率、致死率的重要原因。SAH后CVS的病因和機制仍不清楚。有研究顯示CVS與血管內及周圍一氧化氮(NO)含量下降有關，外源性NO難以應用于CVS，有效的NO供體成為研究熱點。本研究觀察內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、細胞間黏附分子(ICAM)-1、肌糖蛋白 C(TN-C)、前列腺素(PGF)F2α等因子在SAH后CVS發生時的表達變化。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 雄性SD大鼠42只，體重290～350 g，由南昌大學動物實驗中心提供，自由進食，晝夜節律喂養。主要實驗試劑Trizol-A、cDNA 合成試劑盒、逆轉錄聚合酶鏈反應試劑盒、ELISA試劑盒。對照組6只：不作任何處理；假注血組18只：48 h內兩次枕大池穿刺注入生理鹽水0.3 ml；SAH組18只：48 h內兩次枕大池穿刺注入自體動脈血0.3 ml。假注血組及SAH組分為1 d、7 d、11 d 3個亞組，每組 6只。

1.2 模型制作 取SD大鼠麻醉后，后頸部及右側股動脈區備皮、消毒后；大鼠仰臥位，鈍性分離右側股動脈抽取股動脈血0.3 ml留以備用，改俯臥位后鈍性分離枕部肌肉暴露枕骨，用1 ml針管穿刺入枕大池，在2 min內將0.3 ml動脈血注入枕大池，縫合傷口。48 h后同法取左側股動脈血0.3 ml注入枕大池，制成大鼠SAH動物模型。假注血組2次注入枕大池為生理鹽水。

1.3 標本采集及測定 不同時間點抽取動物血液標本放入含100 g/L依地酸二鈉60 μl試管中混勻,采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定血清eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α，嚴格按試劑盒說明書操作。分別于建模后第1、7、11天處死大鼠，剝離其腦組織對顳葉皮質切片進行染色，按試劑盒操作，觀察顳葉皮質切片中神經元凋亡情況：所有受試動物進行顳葉皮質神經元凋亡監測，凋亡指數為顳葉皮質切片1 000個神經元中的TUNEL染色陽性細胞。剝離其基底動脈組織部分行石蠟包埋后行HE染色檢查，光鏡下觀察并測量基底動脈血管內徑，橫截面積(面積采用顯微鏡計算機圖像分析系統測量基底動脈橫截面積)，血管舒張度(D/T值：指動脈血管內徑與管壁厚度之間的比值)。另一部分凍存于-80℃冰箱中，統一行eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α檢測，將eNOS、ICAM-1、TN-C、PGF2α和管家基因(β-actin)進行實時熒光定量 PCR。反應條件:95℃變性2 min，40個循環94℃變性20 s,58℃(eNOS)、61℃(ICAM-1)、56℃(TN-C)、55℃(PGF2α)退火20 s,72℃延伸30 s,74℃讀板。擴增產物經脂糖凝膠電泳后，用內參照β-actin光密度值標化eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α mRNA的吸光度值，得到eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α mRNA表達的相對含量。eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF-2α及β-actin序列如下:eNOS正義引物:5'-CCGGCTGCCACCTGATCCTA-3',反義引物:5'-AACATGTGTCCTTGCTCGAGG CA-3'。ICAM-1正義引物:5'- AGACACAAGCAAGAGAAGAA-3',反義引物:5'- GAGAAGCCCAAACCCGTATG-3'。TN-C正義引物:5'-TCCTGCTGACTGTCACAATC-3',反義引物:5'-TGCTCACATACACATTTGCC-3'。PGF2α正義引物:5'-ACTGGCATGCTCCCCAGCGGA-3',反義引物:5'-GTGCCGTTAGTCTCTGAGGCG-3'。β-actin正義引物:5'-TACAACCTCCTTGCAGCTCC-3',反義引物:5'-GGATC TTCATGAGGTAGTCATTC-3'。

1.4 統計學分析 采用SPSS13.0統計軟件包進行t檢驗、χ2檢驗及Spearman等級相關分析法。

2 結 果

2.1 基底動脈標本觀察 對照組和假注血組腦干腹側基底動脈周圍無血凝塊，基底動脈內皮結構完整血管管腔較大，內膜平滑肌呈扁平狀，無卷曲；SAH組見基底動脈周圍可見明顯的凝血塊，但隨著時間的推移，周圍凝血塊大小和范圍逐漸減少，基底動脈內皮結構排列紊亂，內徑減小，內膜平滑肌細胞排列紊亂，卷曲皺折，厚薄不均，細胞外間質增多，7 d達到最明顯改變，11 d上述改變明顯減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠基底動脈組織學形態(HE，×100)

2.2 各組基底動脈橫截面積及管壁比較 基底動脈行 HE 染色后，對照組和假注血組基底動脈無明顯痙攣：SAH組第1、7和11天基底動脈橫截面積、血管內徑和D/T值均明顯低于對照組和假注血組(P<0.05)。對照組和假注血組基底動脈橫截面積、血管內徑和D/T值差異不明顯，無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠基底動脈橫截面積、血管內徑和D/T值

與對照組比較：1)P<0.05;與同時段假注血組比較：2)P<0.05

2.3 顳葉皮質神經元凋亡指數比較 對照組和假注血組第1、7和11天大鼠顳葉皮質神經元結構緊湊，數目正常，排列整齊；對照組顳葉神經元凋亡指數為(1.7±1.0)%，假注血組1、7、11 d顳葉神經元凋亡指數為(1.8±1.0)%、(2.0±1.1)%、(2.1±0.9)%。SAH組大鼠顳葉皮質神經元結構松散，數目減少，排列紊亂，顳葉神經元凋亡指數SAH組1 d明顯升高〔(17.6±2.4)%〕，7 d顳葉神經元凋亡指數升高最明顯〔(32.0±4.4)%〕，SAH組11 d后指數逐漸降低〔(28.7±4.0)%〕(P<0.05)。

2.4 血清eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α濃度 SAH組各eNOS表達水平明顯低于對照組及同時間點假注血組，以7 d降低最明顯(P<0.05)。SAH組ICAM-1、TN-C表達水平明顯高于對照組及同時間點假注血組(P<0.05)。SAH組PGF2α表達在1 d及7 d組水平明顯高于對照組及同時間點假注血組(P<0.05)，且隨時間逐漸降低，7 d和11 d表達水平明顯低于1 d。見表2。

2.5 各組大鼠基底動脈eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α mRNA表達情況 SAH組大鼠基底動脈eNOS表達明顯低于對照組和同期假注血組，ICAM-1、TN-C、PGF2α表達明顯高于對照組和同期假注血組(P<0.05)。見表3。

2.6 eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α在SAH大鼠血清中表達與神經元凋亡指數的相關性分析 大鼠SAH組7 d eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α各血清值變化最為明顯，通過顳葉神經元凋亡指數與eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α表達相關分析結果顯示，eNOS表達與顳葉神經元凋亡指數呈負相關(r=-0.586,P=0.01)，ICAM-1、TN-C與PGF2α表達與顳葉神經元凋亡指數呈正相關(r=0.652,P=0.02;r=0.696,P=0.03;r=0.784,P=0.02,P<0.05)。

表2 各組大鼠血清eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α表達水平

與對照組比較：1)P<0.05;與同期假注血組比較：2)P<0.05;與SAH組1 d比較：3)P<0.05，下表同

表3 各組大鼠基底動脈eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α mRNA表達水平

3 討 論

CVS是SAH的常見并發癥，也是最嚴重的并發癥之一,其發病率為30%～90%，輕者可引起腦供血不足，嚴重可發生遲發性缺血障礙(DID)，導致腦梗死甚至死亡，是SAH后致殘和死亡的主要原因〔1,2〕。NO是由L-精氨酸與分子氧在NOS 的催化下生成的，作為一種可以通過生物膜擴散的氣體自由基，其可調節調節心血管系統、神經系統和免疫功能，且能快速彌散進入平滑肌細胞從而引起血管松弛,是維持腦血管張力的重要因子之一。eNOS作為NOS的異構體，主要存在于內皮細胞和神經細胞，可持續低量地合成、釋放NO，使血管處于舒張狀態〔3,4〕，是預測SAH后CVS的有用指標之一〔5〕。張瓏等〔6〕通過血管內基因轉染的方法，來了解eNOS防治SAH后遲發性CVS的療效，結果發現，在對以內皮功能失常和內皮依賴性舒血管作用降低為特點的OVS中，eNOS可作為一種特異性治療，可能對于SAH后遲發性CVS具有一定的療效。ICAM-1高表達可促進單核細胞和淋巴細胞與內皮細胞黏附,使氧自由基、蛋白溶酶、白三烯、血小板活化因子等與內皮細胞反應，直接損傷內皮或導致內皮功能障礙，從而引起炎癥反應〔7～10〕。TN-C是一種大分子量的細胞外基質的糖蛋白，在胚胎發育、炎性反應以及傷口愈合的過程中可一過性的表達，其特征與纖維連接蛋白和層黏連蛋白有許多相似之處〔11〕。PGF2α〔12,13〕是通過參與其他自體活性物質、神經遞質和激素的調解而發揮作用的。在生理狀態下，主要作用于血管和平滑肌，參與血小板凝集、炎癥反應、神經沖動傳導和細胞生長等。PGF2α在細胞水平的具體作用機制因細胞種類不同，發揮的作用也不同。

本研究通過以二次注血法將自體動脈血直接注入蛛網膜下腔造模，造模后可見基底動脈內皮結構排列紊亂，卷曲皺折，厚薄不均，內膜下及外膜可見炎性細胞浸潤，血管管徑變細，周圍可見明顯的凝血塊，但隨著時間的推移，周圍凝血塊大小和范圍逐漸減少，提示SAH后CVS造模成功〔14,15〕。各組基底動脈橫截面積及管壁比較發現，對照組和假注血組基底動脈橫截面積、血管內徑和D/T值差異不明顯，而SAH組明顯低于對照組和假注血組。SAH組大鼠顳葉皮質神經元結構松散，數目減少，排列紊亂，凋亡數量明顯高于對照組及假注血組,進一步證實了SAH后CVS造模成功。

本實驗表明eNOS表達下調，可能與SAH后血管內皮細胞的功能存在一定的關系，參與了SAH后CVS的發展，SAH后ICAM-1、TN-C、PGF2α影響血管內皮功能的穩定性，由此可引發的一系列病理反應，導致SAH后CVS的形成。eNOS表達與顳葉神經元凋亡指數呈負相關，ICAM-1、TN-C與PGF表達與顳葉神經元凋亡指數呈正相關。本實驗結果提示，eNOS表達可能對SAH后的神經損傷具有保護作用；而ICAM-1、TN-C與PGF2α的高表達可誘發腦細胞的凋亡,人為改變SAH后eNOS、 ICAM-1、TN-C與PGF2α的表達可能阻斷SAH后的病理過程。

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〔2013-12-07修回〕

(編輯 趙慧玲/曹夢園)

江西省科技廳科技支撐項目(20111BBG70022-4)

郭 華(1972-)，男，主任醫師，主要從事干細胞及腦血管病的研究。

吳 雷(1980-)，男，博士，主治醫師，主要從事干細胞及腦血管病的研究。

R74

A

1005-9202(2015)12-3206-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.009