經典瞬時受體電位通道3在染料木黃酮抑制非小細胞肺癌H1299細胞增殖中的作用

凌藝輝 王 斌 吳建軍 蔣義國 楊巧媛

(廣州醫科大學公共衛生學院預防醫學系，廣東 廣州 510182)

經典瞬時受體電位通道3在染料木黃酮抑制非小細胞肺癌H1299細胞增殖中的作用

凌藝輝 王 斌1吳建軍 蔣義國 楊巧媛

(廣州醫科大學公共衛生學院預防醫學系，廣東 廣州 510182)

目的 旨在探討經典瞬時受體電位(TRPC)通道(TRPC)3在染料木黃酮(Gen)抑制非小細胞肺癌細胞增殖中的作用。方法 用MTT法檢測癌細胞增殖活力，用熒光定量RT-PCR和蛋白免疫印跡法檢測TRPC通道表達水平，用1-油酰基-2-乙酰基-sn-丙三醇(OAG)誘導的鈣內流實驗檢測TRPC3功能。結果 在所有Gen給藥濃度，H1299細胞增殖率均低于A549細胞(P<0.01)。H1299細胞的TRPC3 mRNA和蛋白表達都顯著高于A549細胞(P<0.01)。用shNC和shC3i質粒轉染H1299細胞，在Gen處理24、48、72 h三個時間點，shC3i及Gen處理兩個轉染細胞的增殖率都低于shNC細胞(P<0.01)。在24、48 h，shC3i,shNC+Gen和shC3i+Gen三組間無差異，在72 h，shC3i+Gen組低于shC3i和shNC+Gen組(P<0.05)。Gen對shC3i細胞的增殖抑制率(9.9%)低于其對shNC細胞的增殖抑制率(56%)。Gen處理不影響H1299細胞TRPC3蛋白表達，但在OAG誘導的鈣內流檢測，shC3i細胞，Gen處理的shNC及shC3i細胞的瞬時鈣內流均低于shNC細胞，Gen對shC3i細胞鈣內流抑制作用低于其對shNC細胞鈣內流抑制作用。結論 Gen抑制TRPC3通道功能可能是其抑制H1299細胞增殖的作用機制。

染料木黃酮;非小細胞肺癌;瞬時受體電位通道3;鈣;細胞增殖

肺癌是癌癥導致死亡的首要原因〔1〕。非小細胞肺癌病例占肺癌發生的80%～85%，其臨床療效不佳。大豆異黃酮是主要存在于大豆類食品中的一類植物化學物，對多種惡性腫瘤有預防和治療作用〔2〕。染料木黃酮(Gen)是大豆異黃酮中主要的成分，體外和動物實驗結果表明它對多種組織來源癌細胞生長有抑制作用〔3～8〕。Gen通過調節細胞內多種信號通路，如核轉錄因子(NF)κB和蛋白激酶B(PKB)/絲氨酸-蘇氨酸激酶(AKT)等，抑制癌細胞增殖，誘導細胞周期阻滯或凋亡，抑制遷移和侵襲〔2〕。鈣離子作為重要細胞信號分子參與多種細胞生物學過程，鈣離子及相關通道蛋白是近年來研究癌癥的重要靶分子。鈣庫操控鈣內流(SOCE)和受體操控鈣內流(ROCE)被認為是非興奮細胞鈣內流的主要鈣通道機制。Gen能抑制細胞的ROCE和SOCE〔9〕。經典瞬時受體電位(TRPCs)家族成員以同聚體或異聚體方式構成細胞膜上離子通道，參與細胞SOCE和ROCE通道構成。目前有關Gen對P53缺失的非小細胞肺癌生長的抑制作用機制及TRPCs通道是否參與Gen的抑癌作用尚未見報道。本研究旨在探索TRPCs通道與Gen抑制非小細胞肺癌生長的關系。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 抗TRPC3抗體購自Alomone Labs(Jerusalem,Israel)，抗GAPDH抗體購自武漢博士德，二抗抗體購自Cell Signaling(Danvers,MA,USA)。Gen和1-油酰基-2-乙酰基-sn-丙三醇(OAG)購自Sigma-aldrich公司。RNA提取用Trizol試劑，穩定干擾質粒構建用pSilencerTMpuro試劑盒，T4連接酶，質粒轉染用Lipofectamine2000脂質體，Fluo-4/AM熒光染料，胎牛血清和培養基DMEM購自Invitrogen公司。蛋白提取，定量及蛋白免疫印跡試劑購自Bio-Rad公司。實時熒光定量RT-PCR 試劑盒購自大連TaKaRa寶生生物工程有限公司。

1.2 細胞培養 人非小細胞肺癌細胞A549和H1299購自中山大學實驗動物中心細胞庫，用含10%胎牛血清的Dulbecco modified Eagle培養基(DMEM)，5% CO2、37℃培養箱培養。

1.3 穩定干擾細胞系建立 以TRPC3為目的基因的發夾RNA干擾質粒按照pSilencerTMpuro試劑盒說明書構建。干擾序列shC3i為5’-GGACUGAAAUGCUAAUUAUTT-3’，由Invitrogen公司合成。陰性對照shNC序列由試劑盒自帶。細胞轉染按照Lipofectamine2000脂質體試劑盒說明書操作。轉染操作24 h后，用嘌呤霉素篩選陽性轉染細胞。1個月后，用蛋白免疫印跡法鑒定干擾效率。

1.4 熒光定量RT-PCR及引物 按照Trizol說明書提取總RNA。濃度和純度檢測用紫外分光光度儀。TRPC1，TRPC3，TRPC4，TRPC6和β-actin的特異性引物合成參照文獻〔10〕。定量RT-PCR按照試劑盒說明書。用2-ΔΔCT計算相對表達量。

1.5 蛋白免疫印跡 用全蛋白提取試劑盒說明提取全蛋白，用雙金雞寧酸(BCA)蛋白濃度測定法進行定量。50 μg總蛋白等量上樣，10%的SDS-PAGE分離蛋白，濕法轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。5%脫脂奶室溫封閉2 h后，抗TRPC3抗體用5%脫脂奶1∶1 000稀釋，4℃孵育過夜。用含吐溫20的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液(TBST)漂洗3次后加入1∶5 000稀釋的二抗，室溫下孵育1 h，電化學發光法(ECL)熒光發光試劑顯影，檢測條帶。

1.6 細胞增殖檢測 細胞以100 μl/孔(2×103個細胞)接種于96孔板，每種5個復孔。24 h后，換成含二甲基亞砜(DMSO)或Gen的新鮮培養基。在設計時間點每孔加入10 μl四甲基偶氮唑鹽(MTT)，培養4 h后，棄培養基，每孔加100 μl DMSO，震動溶解甲臜，用酶聯免疫檢測儀在490 nm波長處測定其光吸收值。不同濃度Gen對細胞增殖影響試驗，以0劑量組為對照計算相對增殖率。Gen對穩定轉染細胞增殖影響試驗，以給藥0 h為參照計算相對增殖率。半抑制率(IC50)用改良寇氏法計算。

1.7 Ca2+內流實驗 胞質Ca2+濃度用Ca2+敏感性熒光染液Fluo-4/AM 染色標記后，利用激光共聚焦顯微鏡檢測(日本Olympus，FV1000-IX71)。細胞接種后，待生長至50%左右，換成含DMSO或50 μmol/L Gen的新鮮培養基，藥物預處理4 h后，加入含2 μmol/L 的Fluo-4/AM的PBS，避光孵育30 min，PBS漂洗3 次，加入200 μl含2 mmol/L鈣的PBS，同時加入DMSO或50 μmol/L的Gen。綠色熒光Fluo-4激發光波長為488 nm，發射波長為525 nm。〔Ca2+〕i的變化用△F/F0 比值呈現，其中F0為未作任何處理時細胞的基礎熒光值，△F = F-F0。

1.8 統計學方法 用SPSS13.0統計軟件進行t檢驗、SNK檢驗。

2 結 果

2.1 Gen對A549和H1299細胞增殖的抑制作用 各濃度Gen對H1299細胞增殖抑制作用均顯著高于對A549細胞增殖的抑制作用(P<0.01)。Gen對A549細胞增殖的最大抑制率為(36.1±3.22)%，對H1299細胞增殖的最大抑制率為(86.5±3.9)%。說明H1299細胞對Gen的敏感性更高。見圖1。

與H1299比較：1)P<0.01

2.2 TRPCs通道分子在A549和H1299細胞的表達比較 TRPC5和TRPC7在兩種癌細胞未檢測到，TRPC1、4和6的表達在兩種細胞間無差異，而H1299細胞的TRPC3 mRNA表達水平顯著高于A549細胞(P<0.01)。進一步用蛋白免疫印跡法檢測TRPC3蛋白表達情況，H1299細胞TRPC3蛋白表達比A549細胞高約1.5倍，差異顯著(P<0.01)。見圖2。

與A549比較：1)P<0.01

2.3 TRPC3干擾削弱Gen對H1299細胞增殖的抑制作用 shC3i細胞中TRPC3蛋白表達量比shNC細胞中該分子表達量顯著降低(P<0.01)。根據前面不同劑量Gen對H1299細胞增殖抑制作用結果計算半抑制率(IC50)為46.3 μmol/L，在此選擇IC50近似值50 μmol/L濃度處理兩種穩定轉染細胞。結果顯示在3個檢測時間點，shNC+Gen、shC3i+Gen和shC3i細胞增殖水平都顯著低于shNC細胞(P<0.01)。在24、48 h，shNC+Gen、shC3i和shC3i+Gen三組間比較無差異(P>0.05)。在72 h，shC3i+Gen組細胞增殖率低于shNC+Gen和shC3i組(P<0.01)，且shNC+Gen組相對shNC組，增殖抑制率為56.01%，而shC3i+Gen組相對shC3i組，增殖抑制率為9.9%。見圖3。

與shNC組比較：1)P<0.01,與shC3i和shC3i+Gen組比較：2)P<0.05

2.4 Gen處理對TRPC3蛋白表達和通道鈣內流的影響 用Gen處理H1299細胞，分別檢測在8、12、24 h的TRPC3蛋白表達，結果顯示Gen處理不影響TRPC3的蛋白表達。TRPC3參與細胞膜上鈣內流通道構成，能被細胞內二酰基甘油(DAG)直接激活，引起細胞外鈣內流。用DAG類似物OAG作為激動劑，檢測H1299細胞表達TRPC3蛋白的功能以及Gen對此功能的影響。結果顯示，shC3i細胞及兩個Gen處理組細胞與shNC細胞相比，OAG誘導鈣內流的峰值和平臺期均顯著降低(P<0.01)。shC3i+Gen組細胞鈣瞬時升高的峰值低于shNC+Gen和shC3i組細胞，但只與shNC+Gen組細胞有統計學差異(P<0.01)。見圖4。

與shNC組比較，shNC+Gen組與shC3i+Gen組比較：1)P<0.01

3 討 論

人群病例對照和隊列研究報道，膳食異黃酮攝入與從不吸煙男性肺癌的發生呈負相關〔11，12〕。Gen是食物異黃酮中的重要成分，眾多的研究證明其對多種組織來源的癌細胞生長有抑制作用〔2〕。在非小細胞肺癌，Gen抑制H460和H322細胞生長，促進p21WAF1表達，誘導細胞G2/M期阻滯和凋亡〔13〕。有研究者在A549細胞上進一步證明Gen誘導p21WAF1表達依賴于P53蛋白表達〔14〕，Gen對P53缺失的H1299細胞生長亦有較強的抑制作用，誘導細胞周期阻滯，并未引起細胞凋亡增加。本研究用A549和H1299兩種非小細胞肺癌細胞驗證Gen對癌細胞增殖的抑制作用。結果表明Gen對兩種細胞增殖均有抑制作用，抑制H1299細胞增殖呈明顯的濃度依賴性，且在所有給藥濃度組，對H1299細胞的抑制率更高。同時檢測兩種細胞TRPCs通道表達，發現在mRNA和蛋白水平，H1299細胞的TRPC3表達均顯著高于A549細胞。

Ca2+作為細胞內重要信號分子，通過調節下游信號通路，參與細胞的周期，增殖，分化，凋亡等生命過程。TRPC3與TRPC6基因序列有75%同源，它參與細胞膜上SOCE和ROCE通道組成，能被激素或各種生長因子刺激而激活。研究表明TRPC6通道分子表達促進乳腺癌，前列腺癌和肝癌等癌細胞生長，而TRPC3表達增高與在卵巢癌的發展相關，阻斷TRPC3和TRPC6通道或下調表達均抑制癌細胞生長〔15〕。本研究也表明穩定干擾的shC3i細胞比shNC細胞增殖活力明顯下降，同時抑制OAG誘導的鈣內流。說明功能性的TRPC3通道蛋白表達影響H1299細胞的生長活力。但是用Gen處理H199細胞后，并未發現TRPC3蛋白表達發生改變。因此，推測Gen對H1299細胞增殖的抑制作用可能是與通道活化相關，而不是直接調控分子表達。

在非興奮細胞，酪氨酸磷酸化是ROCE和SOCE活化的重要調節機制，研究表明Gen作為酪氨酸激酶抑制劑能抑制TRPC3通道介導的ROCE和SOCE〔16〕，而且此抑制作用對受體激動或OAG激動均有效。本文亦發現Gen預處理的shNC細胞，OAG誘導的鈣內流比未給藥shNC細胞明顯降低，這種藥物的抑制效果和單獨TRPC3干擾的抑制作用相同，但shC3i細胞給藥處理后與未給藥的shC3i細胞鈣內流相比較，抑制效果明顯降低。說明TRPC3表達下調降低Gen對OAG誘導鈣內流的抑制作用。在增殖試驗中同樣也發現，抑制TRPC3表達消除或削弱了Gen對細胞增殖的抑制作用。這些結果提示Gen能抑制H1299細胞的TRPC3鈣通道活化，而且這種抑制作用可能是其對細胞增殖抑制的重要原因。綜上，本文結果提出了Gen抑制非小細胞肺癌生長的一種可能的分子機制。

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〔2013-12-19修回〕

(編輯 苑云杰)

國家自然科學基金(81102099)；廣州市科技計劃項目(2013J4100036)

楊巧媛(1975-)，女，博士，副教授，主要從事環境致癌研究。

凌藝輝(1975-)，男，碩士，講師，主要從事癌癥化學預防研究。

R734

A

1005-9202(2015)12-3220-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.015

1 南方醫科大學公共衛生與熱帶醫學學院職業衛生與職業醫學系