環磷腺苷效應元件結合蛋白磷酸化在胰島素樣生長因子-1抑制耳蝸毛細胞凋亡中的作用

宮 亮 陳 冬 李 里

(遼寧醫學院附屬第一醫院耳鼻咽喉科，遼寧 錦州 121000)

環磷腺苷效應元件結合蛋白磷酸化在胰島素樣生長因子-1抑制耳蝸毛細胞凋亡中的作用

宮 亮 陳 冬 李 里1

(遼寧醫學院附屬第一醫院耳鼻咽喉科，遼寧 錦州 121000)

目的 探討磷酸化環磷腺苷效應元件結合蛋白(P-CREB)對胰島素樣生長因子(IGF)-1抑制小鼠毛細胞凋亡的作用。方法 體外培養新生小鼠耳蝸基底膜。實驗分為A組：正常對照培養液；B組：慶大霉素(GM)(0.5 mmol/L)；C組：GM(0.5 mmol/L)+IGF-1(1 ng/ ml)；D組：GM(0.5 mmol/L)+ IGF-1(10 ng/ ml)；E組GM(0.5 mmol/L)+ IGF-1(50 ng/ ml)；F組：GM(0.5 mmol/L)+ IGF-1(100 ng/ ml)。培養24 h后收集細胞及固定。應用TUNEL法觀察各組耳蝸毛細胞的凋亡情況。應用Western印跡及RT-PCR法觀察P-CREB的表達情況。結果 A組無凋亡細胞。B組檢測到凋亡細胞。C組細胞凋亡較B組明顯減少。D組凋亡細胞減少最明顯(與B組相比，P<0.05)。E組及F組凋亡細胞較D組有所增加。P-CREB：Western印跡結果及RT-PCR結果表明：A組及B組P-CREB蛋白及mRNA表達較低。與B組相比，C、D、E及F組P-CREB蛋白及mRNA明顯增加，以D組增加最明顯。結論 IGF可能通過激活CREB磷酸化抑制毛細胞凋亡。

毛細胞；凋亡；胰島素樣生長因子；磷酸化環磷腺苷效應元件結合蛋白(P-CREB)

環磷腺苷效應元件結合蛋白(CREB)屬于cAMP反應元件結合蛋白，其調節的經典通路為G 蛋白-cAMP-PKA 通路。該通路主要是磷酸化激活CREB；激活的CREB之間形成同源二聚體或和其他蛋白結合形成異源二聚體，后與真核生物啟動子中的CRE 結合對CREB 靶基因轉錄進行調控。胰島素樣生長因子(IGF)-1是一種調控耳蝸生長發育及細胞間協調穩定的生長因子。目前對于IGF-1在神經細胞損傷防護中的研究較為深入，但在耳蝸發育過程中及其在耳蝸毛細胞和螺旋神經節中保護作用及其機制仍不明確。研究表明IGF-1可以抑制小鼠耳蝸毛細胞凋亡。Lebesgue等〔2〕研究表明：CREB磷酸化(P-CREB)后可以上調Bcl-2，進而抑制海馬椎體細胞凋亡。P-CREB參與抑制神經細胞，腫瘤細胞和腎臟細胞等多種細胞凋亡〔3〕。本文探討IGF-1抑制凋亡的作用與P-CREB關系。

1 材料與方法

1.1 材料 小牛血清購自美國標準生物品收藏中心，TUNEL 檢測試劑盒購自美國Clontech公司，RT-PCR 試劑盒購自美國Qiagen 公司，IGF-1 由美國Genentech 公司惠贈，抗p-CREB抗體及二抗購自美國Santa Cruz 公司。

1.2 細胞培養及分組 耳蝸基底膜進行離體培養24 h后更換培養液。實驗分為A組：正常對照培養液；B組：慶大霉素(GM)(0.5 mmol/L)；C組：GM(0.5 mmol/L)+IGF-1(1 ng/ ml)；D組：GM(0.5 mmol/L)+ IGF-1(10 ng/ ml)；E組GM(0.5 mmol/L)+ IGF-1(50 ng/ ml)；F組：GM(0.5 mmol/L)+ IGF-1(100 ng/ ml)。24 h后吸出培養液，再用10%甲醛磷酸鹽緩沖液固定樣品4 h以上，制作各組耳蝸組織鋪片。

1.3 耳蝸毛細胞凋亡檢測 對各組耳蝸基底膜細胞進行TUNEL染色，加入脫氧核苷酸末端轉移酶混合液；陽性對照用DNA酶I，分別以50 mg/L，0.1 g/L，0.5 g/L和1.0 g/L預處理組織，應用多聚甲醛固定后，將其置于穿透液中，陽性結果為細胞核紅染。激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4 Western印跡檢測P-CREB蛋白的表達 收集細胞，提取總蛋白，經聚丙烯酰胺凝膠電泳后，應用增強化學發光法檢測P-CREB蛋白表達。應用HPlsA 1000圖文分析系統分析膠片，用P-CREB與β-actin灰度值的比值表示P-CREB的相對表達量。

1.5 P-CREB mRNA表達檢測 采用RT-PCR技術，Access RT-PCR系統將提取的1 μg總RNA擴增成DNA目的片段。反應循環參數：55℃ 30 min；94℃ 2 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，共35個循環；72℃ 10 min；4℃保存。P-CREB引物：5' GGATCCACGAGCAGAGTCCC 3；5' CCGCCAACCAAGTTCAAGTTCACAGG 3'，235 bp；內參照β-actin：5'CCGTTGACATCCGTAAAGAC 3'，5' GCCGGTGGACAGTGAGGC 3'，200 bp。P-CREB的相對表達水平為P-CREB與β-actin的灰度比值。

1.6 統計學方法 采用SPSS15.0統計軟件進行t檢驗和Pearson相關分析。

2 結 果

2.1 各組細胞凋亡情況 B、C、D、E、F組加入GM后底回和中回基底膜均存在TUNEL染色陽性細胞，而A組未發現。加入IGF-1后，各組中回和底回毛細胞和螺旋神經節TUNEL染色陽性細胞要明顯少于B組。不同濃度IGF-1都可以有效抑制GM對離體培養的小鼠耳蝸基底膜細胞的凋亡過程，10 ng/ml IGF-1是體外培養HC及SGC的最佳藥物濃度。超過該濃度后凋亡細胞數要顯著增高。見圖1、表1。

圖1 各組凋亡細胞觀察(×400)

2.2 耳蝸毛細胞P-CREB蛋白及mRNA相對表達量 A組及B組P-CREB蛋白及mRNA表達較低。與B組相比，C、D、E組及F組P-CREB蛋白及mRNA明顯增加，以D組增加最明顯。見圖2、表1。

2.3 相關性分析 凋亡細胞率與P-CREB蛋白及mRNA呈負相關(r=-0.987，-0.979，均P<0.05)。

表1 各組細胞凋亡率、細胞P-CREB蛋白及mRNA相對表達量

與A組相比：1)P<0.05；與B組相比：2)P<0.05

圖2 各組P-CREB蛋白表達

3 討 論

聽力功能下降的主要原因為耳蝸毛細胞凋亡〔4〕。研究表明敲除IGF-1基因的鼠在內耳生長發育期出現細胞凋亡〔5〕，同時聽力出現減退，這說明IGF-1可以在一定程度上調節內耳毛細胞凋亡〔6〕。Lakhani等〔7〕發現IGF-1可以減少耳蝸毛細胞凋亡。前期結果表明〔1〕，IGF-1使GM誘導的小鼠耳蝸毛細胞凋亡明顯減少，進而保護耳蝸毛細胞，但機制不清楚。

CREB在細胞核存在，CREB分子Ser133位點被磷酸化刺激后，CREB具有了轉錄活性，同時與CBP結合后與基礎轉錄復合物之間通過相互作用從而進行靶基因轉錄，CBP只能與P-CREB結合，故未磷酸化CREB不能完成轉錄功能。Peruzzi等〔8〕研究表明，IGF-1作用于神經細胞時P-CREB增加，未磷酸化的CREB蛋白無變化，表明IGF-1保護神經細胞時通過使P-CREB具有轉錄活性進而調控轉錄。

本文研究結果說明GM導致毛細胞凋亡并致耳蝸毛細胞損傷。IGF-1可以抑制毛細胞凋亡。應用IGF-1后細胞的凋亡減輕，說明IGF-1有抑制凋亡的作用，同時出現P-CREB明顯升高，說明在IGF-1抑制凋亡的過程中 CREB出現磷酸化。

1 Guan J.Insulin-like growth factor-1(IGF-1)derived neuropeptides，a novel strategy for the development of pharmaceuticals for managing ischemic brain injury[J].CNS Neurosci Ther，2011;17(4)：250-5.

2 Lebesgue D，Vivien Chevaleyre V，Zukin RS，etal.Estradiol rescues neurons from global ischemia induced cell death：multiple cellular pathways of neuroprotection〔J〕.Steroids，2009;74：555-61.

3 熊 果，馬康華.cAMP反應元件結合蛋白(CREB)與細胞凋亡〔J〕.基礎醫學與臨床，2011;31(3)：328-30.

4 Hoang Dinh E，Ahmad S，Chang Q，etal.Diverse deafness mechanisms of connexin mutations revealed by studies using in vitro approaches and mouse models〔J〕.Brain Res，2009;1277：52.

5 Camarero G，Villar MA，Contreras J，etal.Cochlear abnormalities in insulin-like growth factor-1 mouse mutants〔J〕.Hear Res，2002;170：2-11.

6 Savage MO，Camacho-Hubner C，Dunger DB.Therapeutic applications of the insulin-like growth factors〔J〕.Growth Horm IGF Res，2004;14：301-8.

7 Lakhani SA，Masud A，Kuida K，etal.Caspases 3 and 7：key mediators of mitochondrial events of apoptosis〔J〕.Science，2006;311：847-51.

8 Peruzzi，M Prisco，A Morrione，etal.Antiapoptotic signaling of the insulin-like growth factor-I receptor through mitochondrial translocation of c-Raf and Nedd4〔J〕.J Biol Chem，2001;276：25990-6.

〔2013-12-18修回〕

(編輯 苑云杰)

遼寧省教育廳高等學校科研項目(2014A460)

陳 冬(1972-)，男，教授，博士，主要從事頭頸惡性腫瘤研究。

宮 亮(1980-)，男，主治醫師，碩士，主要從事頭頸惡性腫瘤研究。

R76

A

1005-9202(2015)12-3246-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.026

1 遼寧醫學院附屬第一醫院風濕科