維生素D受體基因多態性與Graves病易感性的關系

龍 雄 吳文飛 胡卓清 周智明

(南方醫科大學附屬小欖醫院急診科，廣東 中山 528415)

維生素D受體基因多態性與Graves病易感性的關系

龍 雄 吳文飛 胡卓清 周智明

(南方醫科大學附屬小欖醫院急診科，廣東 中山 528415)

目的 探討維生素D受體(VDR)基因ApaI(rs7975232)單核苷酸多態性與漢族人群Graves病的關系。方法 選取Graves病患者260例和對照組221例，收集相關資料，檢測甲狀腺相關激素及25羥維生素D〔25(OH)D〕水平。應用聚合酶鏈式反應-限制性長度多態性(PCR-RFLP)對樣本基因分型。分析基因多態性與Graves病、25(OH)D與促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)滴度之間的相關性，25(OH)D及TRAb水平在不同基因型者之間的差異。結果 (1)Graves病組C等位基因及CC基因型分布頻率高于對照組(C vs.A：57.1% vs.47.3%，χ2=9.260，P=0.002；CC vs.AA：χ2=7.912，P=0.005)；相對于基因型AA者，CC基因型增加Graves病發病風險(OR=2.003，95%CI：1.235～3.246)。(2)Graves病初發組中，血清25(OH)D水平較對照組顯著降低〔(14.74±3.10)vs(20.98±2.82)ng/ml，F=50.9，P<0.001〕；25(OH)D與TRAb水平呈負相關(r=-0.264，P=0.035)；AA基因型者25(OH)D水平較CC+AC基因型者高〔(16.12±3.28)vs(14.16±2.86)ng/ml，F=2.975，P=0.039〕，而TRAb值較低〔(11.65±3.90)vs(18.12±8.63)IU/L，F=3.244，P=0.028〕。結論 VDR基因ApaI(rs7975232)多態性可能與漢族人群 Graves病及其25(OH)D、TRAb水平相關；Graves病初發組患者伴隨低25(OH)D，且與TRAb負相關。

Graves病；維生素D受體；基因多態性

Graves 病是針對甲狀腺自身組織產生特異性抗體為特征的自身免疫復雜性疾病，確切病因仍不清楚。維生素D活化的關鍵酶及其受體是調節固有及適應性免疫內環境穩定的重要環節〔1，2〕。維生素D水平及其受體(VDR)的表達異常可能是致Graves病的免疫機制之一。研究表明多種自身免疫性疾病包括Graves病伴隨低維生素D水平及異常VDR表達〔3〕，在自身免疫疾病中研究較多的為FokI(rs10735810)，TaqI(rs731236)，BsmI(rs1544410)和 ApaI(rs7975232)多態性。Feng等〔4〕分析表明ApaI(rs7975232)多態性與Graves病易感性不相關，而在日本人群中發現該多態性不僅與Graves病相關，它還可能通過影響促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)表達而參與Graves病的發生及發展〔5〕。本研究將探討漢族人群中ApaI(rs7975232)與Graves病遺傳易感性的關系。

1 對象與方法

1.1 對象與分組 病例組入選標準根據內科學Graves病的診斷標準〔6〕，且排除Graves病以外伴(或)曾患其他免疫性疾病者。收集2012年1月至2014年12月在中山市小欖人民醫院和廣東醫附院內分泌科門診就診或住院的Graves病患者260例(男65例，女195例)，平均年齡(37.92±16.22)歲。健康對照組選取同期體檢中心健康者221例(男61例，女160例)，平均年齡(36.00±14.46)，排除有免疫性疾病史和(或)有家族史者。為比較25羥維生素D〔25(OH)D〕水平在病例組與對照組中的區別，選取病例組中初發者64例(男16例，女48例)，平均年齡(32.95±14.52)歲，匹配年齡及性別后選定健康對照組中71例(男22例，女49例)，平均年齡(28.82±15.42)歲。其中初發者為未用藥治療而首次診斷為Graves病者。以上所有入選者均獲知情同意，無任何血緣關系，漢族，祖籍中山和湛江地區。

1.2 主要試劑與儀器 DNA提取用天根生化科技有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒，上海生工公司提供引物合成，寶生物公司提供引物合成及聚合酶鏈式反應-限制性長度多態性(PCR-RFLP)試劑盒。甲狀腺相關檢測項目：激離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、促甲狀腺素(TSH)、TRAb及25(OH)D的檢測儀器為Roche Cobas e 601免疫分析儀，試劑盒為德國羅氏診斷有限公司配套試劑盒。正常參考范圍：FT3：3.1～6.8 pmo1/L；FT4：12～22 pmol/L；TSH：0.27～4.2 μIU/ml；TRAb：0～1.75 IU/L；25(OH)D≥18 ng/ml。

1.3 方法

1.3.1 受試者的資料采集 對受試者進行基本資料的采集：包括年齡、性別、家族史、是否復發、治療情況、甲狀腺腫大情況及等級、是否突眼、家族史情況等。

1.3.2 DNA的提取 取受試者的外周抗凝靜脈血1 000 μl，用血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA 100 μl，-80℃保存待測。

1.3.3 PCR擴增目的片段 運用Primer-Blast設計PCR引物，上游引物：5′GGGCACGGGGATAGAGAAGA3′，下游引物：5′CAGTGGTATCACCGGTCAGC3′。PCR產物大小144 bp，反應體系25 μl：ExTaq 0.125 μl，10×Ex Taq Buffer 2.5 μl，MgCl22 μl，dNTP mixture 2 μl，上下游引物各0.5 μl，DNA模板1 μl，剩余高壓滅菌水補足。反應條件為：94°C預變性3 min，94°C變性30 s，60°C退火30 s，72°C延伸30 s，共35個循環，終末72℃延伸10 min。取5 μl反應產物與1 μl 10×Loading buffer混合，進行2%瓊脂糖凝膠電泳(100 V，30 min)，觀察結果并拍照，只出現一條目的條帶者進入下一步酶切實驗。

1.3.4 基因分型 取產物10 μl，ApaI 1 μl，buffer 2 μl，BSA 2 μl，高壓滅菌水補足至20 μl，在37°C水浴箱反應4 ～6 h。反應后取酶切產物5 μl與1 μl 10×Loading buffer混合，2%的瓊脂糖凝膠電泳(100 V，30 min)。直接在紫外儀下判斷基因型并拍照，結果為其他實驗員進行盲法判讀。

2 結 果

2.1 分型結果 限制性片段長度多態性(RFLP)電泳圖中只出現一條144 bp條帶者為AA基因型，有144 bp、103 bp和41 bp 3條帶者為AC基因型，出現41 bp及103 bp兩條帶為CC基因型。見圖1。

1：AA基因型；2，4，6，7：CT基因型；3，5：CC基因型；M：Marker

2.2 正常對照組樣本基因型分布 經檢驗對照組P=0.065，符合Hardy-Weinberg平衡。

2.3 Graves病組及對照組ApaI(rs7975232)多態性的分布 Graves病與對照組CC、AC和AA 3種基因型分布頻率有統計學差異(χ2=8.185，P=0.017)，等位基因C、A頻率分布亦有統計學意義(χ2=9.260，P=0.002，OR=1.485，95%CI1.151～1.916)。采用基因遺傳的共性模型(CC vs.AC vs.AA)分析顯示，與AA基因型比較，CC個體有增加Graves病的患病風險(CC vs.AA：OR=2.003，95%CI：1.235～3.246，P=0.005)；CC vs.CA(χ2=3.370，P=0.066)及CA vs.AA(χ2=1.664，P=0.197)在兩組中的對比均無統計學意義均P>0.05。見表1。

表1 兩組ApaI(rs7975232)多態性基因型與等位基因頻率比較〔n(%)〕

2.4 Graves病初發組與對照組血清25(OH)D水平比較 經協方差分析校正年齡與性別后，血清25(OH)D水平在Graves病組的初發組與對照組比較有統計學差異〔(14.74±3.10)vs.(20.98±2.82)ng/ml，F=50.9，P<0.001〕。

2.5 血清25(OH)D及TRAb水平在ApaI(rs7975232)多態性各基因型中的分布 協方差分析經校正年齡與性別后在Graves病組的初發組中，3種不同基因型之間血清25(OH)D及TRAb水平有統計學差異(均P<0.05)，與C等位基因攜帶者(CC+CA)相比，AA基因型的血清25(OH)D水平較高(F=2.975，P=0.039)，TRAb值較低(F=3.244，P=0.028)。見表2。

表2 ApaI(rs7975232)多態性與25(OH)D及TRAb的關系

與AA基因型比較：1)P<0.05；與AC基因型比較：2)P<0.05

2.6 Graves病初發組血清25(OH)D濃度與TRAb濃度的Spearman相關分析 Graves病組的初發組患者的血清25(OH)D濃度〔(14.74±3.10)ng/ml〕與TRAb濃度〔16.983±8.83)IU/L〕呈負相關(r=-0.264，P=0.035)。

3 討 論

1，25-二羥維生素D3屬于類固醇類激素超家族，VDR包括一類功能多樣的甲狀腺激素/維甲酸核受體家族成員及細胞膜受體。研究發現維生素D活化的關鍵酶1α羥化酶、(CYP27B1)及VDR的表達均十分廣泛，除表達于小腸、腎和骨細胞這些常見的組織細胞外，許多免疫細胞如單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞及T/B淋巴細胞均表達1α羥化酶及VDR，其中VDR還可表達于甲狀腺細胞〔2〕。關鍵活化酶及受體的廣泛表達提示VDR信號通路非僅調節鈣磷代謝，還參與到多種細胞的增殖、分化、凋亡、免疫反應及代謝等〔6，7〕。

已有多項研究表明維生素D表達和(或)VDR的異常與多種自身免疫性疾病包括Graves病密切相關〔4，5〕。基因多態性可影響VDR表達的結構與功能，VDR的表達改變對靶細胞的功能調節具有重要的意義。CD40-1C/T多態性可能與漢族人群Graves病發病相關。據估計位于染色體12q12-q14上的VDR基因序列存在超過30個單核苷酸多態性(SNP)，而FokI(rs10735810)，TaqI(rs731236)，BsmI(rs1544410)和 ApaI(rs7975232)多態性是目前研究骨代謝及自身免疫疾病的熱點。TaqI(rs731236)，BsmI(rs1544410)和 ApaI(rs7975232)均為位于內含子區域內非改變VDR編碼蛋白的關鍵位點，但研究顯示該3個位點彼此連鎖不平衡，被認為可修飾VDR表達與功能的特殊內含子多態性位點。ApaI(rs7975232)多態性與VDR mRNA轉錄穩定性相關，可能影響下游VDR蛋白的翻譯與修飾。Inoue等〔5〕發現ApaI與日本人群Graves病發病相關，然而Feng等〔4〕meta分析亦顯示該多態性與高加索人Graves病遺傳易感性無明顯相關。康東紅等〔8〕以天津地區為研究對象，認為ApaI不能作為預測Graves病的危險性遺傳標志，但該研究對照組樣本基因型分布經檢驗不符合Hardy-Weinberg平衡，且其未解釋不平衡的原因。目前國內有關的類似研究報道少，需要更廣泛代表的數據予證實ApaI多態性與中國人群Graves病的相關性。

ApaI多態性與Graves病相關性可能通過調節維生素D及間接影響TRAb滴度有關，其機制可能是：(1)Graves病患者外周血淋巴細胞VDR的缺陷表達對維生素D自身下調，再通過體液免疫相關細胞因子上調或下調致TRAb異常表達；(2)VDR致低25(OH)D是由于自身免疫性疾病中存在高 1，25(OH)2D3滴度的負反饋性調節。由于本院暫時無法直接測定1，25(OH)2D3滴度而未進一步分析其相關性，是本次研究的局限性。VDR通路參與免疫平衡的機制目前并不十分明確，其參與固有及適應性免疫過程呈非常復雜的網絡狀結構，如VDR信號通路通過調節相關細胞因子可抑制Th1/Th17細胞、樹突細胞等的成熟分化，相反地促進Th2及相關的調節性T細胞的優勢表達〔9，10〕。維生素D表達的異常和(或)其發揮作用的整條通路或是通過以上淋巴細胞參與自身性免疫炎癥形成，打破甲狀腺自身免疫耐受不可缺少的一環。目前無法鑒別Graves病初發組中低25(OH)D水平究竟是病因還是結果，因為目前的研究大多是觀察性研究。

綜上所述，本研究初步提示VDR基因 ApaI多態性與漢族人Graves病及其25(OH)D水平、TRAb抗體水平相關。Graves病初發患者伴隨低維生素D水平，且與TRAb抗體滴度呈負相關，VDR信號通路可能參與Graves病發生及發展。

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〔2014-09-21修回〕

(編輯 袁左鳴)

中山市科技計劃項目(2014A1FC088)

龍 雄(1978-)，男，副主任醫師，主要從事內分泌疾病研究。

R4

A

1005-9202(2015)12-3254-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.030