不同預處理方式對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用

陳立英，王會軍，陶小雪，廖仁昊，張 穎，崔妍莉，劉芳芳

預先給予短暫的腦缺血預處理（BIP）可誘導缺血耐受（IT）［1］，激活內源性神經(jīng)保護機制，減輕缺血再灌注所致的腦損傷，但人為地誘發(fā)IT是非常困難和難以想象的，在臨床上實施困難。近年來發(fā)現(xiàn)預先給予一些藥物也可誘導IT，此現(xiàn)象稱為藥物預處理［2］，研究表明阿司匹林（ASA）可誘導IT，具有直接神經(jīng)保護作用，其機制可能為ASA的抗炎作用可減輕腦缺血再灌注后的炎癥級聯(lián)反應有關［3］。中藥大黃素甲醚（plyscion，Ply）屬蓼科植物大黃根莖所含的蒽醌衍生物之一，并具有很強的抗炎作用，已有前期研究證明Ply通過抗炎機制而起到腦保護作用［4］，但對IT的影響報道尚少見。本實驗利用大鼠缺血再灌注模型，觀察不同預處理方式對大鼠缺血再灌注損傷保護作用的影響，為缺血性腦血管的治療提供了一種有前途的新方法。

1 材料與方法

1.1 模型制造 將100只健康成年雄性SD大鼠（河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供）按隨機數(shù)值表法分為5組，每組20只。A組：假手術組，B組：腦缺血再灌注組，假手術3d后給予2h大腦中動脈閉塞（MCAO），再灌注22h后處死。C組：腦缺血預處理組，缺血預處理10min，3d后給予2hMCAO，再灌注22h后處死。D組：ASA預處理組，阿司匹林粉劑（河南華利藥業(yè)有限責任 公 司 提 供，批 號：0780633）以 60mg／kg 劑量溶于2mL生理鹽水中，灌胃3次，3d后給予2h MCAO，再灌注22h后處死。E組：Ply預處理組，大黃素甲醚（山東新華制藥股份有限公司提供，批號：0506338；以40mg／kg劑量溶于2mL生理鹽水中，灌胃3次，3d后給予2hMCAO，再灌注22h后處死。給予A、B、C組等量生理鹽水灌胃。

實驗動物用10%水合氯醛3ml／kg腹腔注射麻醉后，用Zea－longa等［5］的大腦中動脈線栓法制作大鼠左側大腦中動脈缺血灌注模型。采用頸部正中切口，結扎并切斷左側頸外動脈，在頸外動脈殘端剪一小口，并插入一根頂端粘有石蠟的尼龍絲線，向上深入至分叉以上（19～21）mm，結扎頸外動脈近心端，缺血（以插漁線成功開始計時）后2h實施再灌注，外拉漁線約20 mm恢復MCA供血，完成缺血預處理。假手術組除不插入漁線外，其余操作相同。造模成功標志：大鼠不能伸展右側前肢（即提尾時右前肢內收屈曲）、行走時向向右轉圈（追尾現(xiàn)象）或行走時向右側傾倒，出現(xiàn)上述三者之一即為造模成功。再灌注3d后用相同方法再次造成MCAO 2h，于處死前進行神經(jīng)功能缺失評分，心臟取血，后斷頭處死。

1.2 神經(jīng)功能缺失評分 按Zea Long5分制［5］標準評分，0分：無功能障礙；1分：不能完全伸展對側前爪；2分：向右側轉圈；3分：向右側傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。

1.3 腦梗死體積測定 再灌注22h每組隨機選取10只動物斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，沿冠狀面用排刀切成5片，每片厚約2mm，置于2%TTC溶液中，避光染色30min，用10%甲醛緩沖液固定24h后用數(shù)碼相機照相，正常腦組織呈紅色，梗死組織呈白色，利用圖像分析法計算各個腦片梗死面積，并計算梗死體積。

1.4 腦組織白細胞介素1β（IL－1β）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）含量測定 再灌注22h后取每組另10只動物用10%的水合氯醛麻醉后處死，取出鼠腦剝離左側皮質，制成100g／L的腦組織勻漿，低溫離心1 5min（3 000r／min）。取上清液采用FFDFr－晶體閃爍計數(shù)儀，用放射免疫法測定各組動物腦組織IL－1β和TNF－α的含量。具體操作按大連生物工程公司生產的試劑盒進行。

1.5 統(tǒng)計學處理 計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，多組比較進行單因素方差分析及兩兩比較q檢驗，兩組間比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1 神經(jīng)功能缺失評分 假手術組無神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)。缺血預處理組、ASA預處理組及Ply預處理組神經(jīng)功能缺失評分與缺血再灌注組比較明顯降低（P＜0.01）。Ply預處理組神經(jīng)功能缺失評分明顯降低，與ASA預處理組比較明顯降低（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 血清NSE含量 腦缺血再灌注組血清NSE含量與假手術組比較明顯升高 （P＜0.05）。缺血預處理組、ASA預處理組及Ply預處理組與腦缺血再灌注組比較血清NSE含量降低（P＜0.01）。Ply預處理組血清NSE含量與ASA預處理組比較明顯降低（P＜0.05）。詳見表1。

2.3 腦梗死體積 假手術組無肉眼可見的梗死灶形成。腦缺血再灌注組大鼠均表現(xiàn)不同程度的梗死灶形成。缺血預處理組、ASA預處理組及Ply預處理組與腦缺血再灌注組比較梗死體積縮小（P＜0.01）。Ply預處理組梗死體積與ASA預處理組比較明顯縮小（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組神經(jīng)功能缺失、NSE、腦梗死體積比較（x±s）

2.4 腦組織IL－1β和TNF－α含量 腦缺血再灌注組腦組織IL－1β和TNF－α含量與假手術組比較明顯升高（P＜0.01）。缺血預處理組、ASA預處理組及Ply預處理組與腦缺血再灌注組比較病變側腦組織IL－1β和 TNF－α含量降低 （P＜0.05）。Ply預處理組腦組織IL－1β和TNF－α含量與ASA預處理組比較明顯降低 （P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組腦組織IL－1和TNF－α含量（x±s） ng／mL

3 討 論

BIP是指對腦組織采用機械刺激，如一次或多次短暫性腦缺血再灌注后，使其對以后較長時間的缺血性損傷產生IT［1］。其機制之一為抑制缺血后的炎癥反應，誘導腦組織產生內源性保護作用，減輕缺血再灌注所致的神經(jīng)損傷。本實驗發(fā)現(xiàn)，提前給予BIP可以使再次缺血時神經(jīng)功能缺失減輕，梗死體積縮小，血清NSE含量下降，均較缺血再灌注損傷組有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。近年來發(fā)現(xiàn)預先給予一些藥物也可誘導IT，此現(xiàn)象稱為藥物預處理［2］，研究表明ASA具有這種作用。提前給予ASA預處理可同樣使再次缺血時神經(jīng)功能缺失減輕，梗死體積縮小，血清NSE含量下降，均較缺血再灌注損傷組有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

炎癥反應可能在缺血再灌注損傷及腦IT中具有重要意義，抗炎治療可減輕缺血再灌注所致的神經(jīng)損傷［6］。Ply屬蓼科植物大黃的根及根莖所含的蒽醌衍生物之一，可通過血腦屏障，并具有很強的抗炎作用。已有前期研究證明Ply通過抗炎機制而起到腦保護作用［4］，但對IT的影響報道尚少見。本實驗發(fā)現(xiàn)，提前給予Ply預處理可以使再次缺血時神經(jīng)功能缺失減輕，梗死體積縮小，血清NSE含量下降，均較ASA預處理組有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），中藥Ply亦可誘導IT產生腦保護作用，效果優(yōu)于ASA。

腦缺血后的再灌注損傷是一系列復雜的病理過程，主要與氧化應激反應、能量代謝障礙、炎性反應、興奮性氨基酸釋放、細胞凋亡及突觸傳遞受阻等有關［7］。其中炎性級聯(lián)反應是一個重要的損傷機制，各種炎癥因子的釋放在損傷機制中起著重要作用，一方面促進炎性細胞黏附于微血管內皮細胞，機械性堵塞微循環(huán)通道，影響組織的血流供應；另一方面促進相關炎性因子釋放，導致白細胞在缺血區(qū)浸潤和聚集，活化的白細胞在缺血區(qū)可釋放大量毒性氧自由基、蛋白水解酶等物質而進一步損傷局部組織血管，導致血管通透性增加而致組織水腫，加重組織損傷［8］。在炎性級聯(lián)反應中以炎性細胞因子（如IL－1β、TNF－α）表達上調為首發(fā)特征，IL－1β、TNF－α作為炎癥反應的起始因子，檢測其含量對衡量腦缺血再灌注損傷有重要意義［9］。本實驗采用放射免疫分析法動態(tài)觀察了不同預處理方式對大鼠腦缺血再灌注側腦組織IL－1β和TNF－α含量的變化。結果發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注腦組織中IL－1β和TNF－α含量明顯升高，且均高于假手術組（P＜0.01）。缺血預處理組、ASA預處理組及Ply預處理組與腦缺血再灌注組比較病變側腦組織IL－1β和TNF－α含量降低 （P＜0.05）。該結果與相關報道一致［10］。表明IL－1β、TNF－α參與了腦缺血再灌注損傷的發(fā)生，在腦缺血性疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉歸中起一定的作用。而不同方式的預處理可能通過降低IL－1β和TNF－α在病灶側的過度表達，并對隨后發(fā)生的腦缺血再灌注損傷起保護性作用。

通過對不同方式預處理的比較，藥物預處理具有相對安全、方便、易于控制劑量的優(yōu)點，且中藥Ply具有更加廣闊的發(fā)展前景。本實驗有可能對臨床缺血性腦血管病的防治提供新的依據(jù)。

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