濾紙片低溫冷凍法保存微生物菌株的臨床應(yīng)用

曹美林，李佳，鄧慧，殷網(wǎng)虎

(鎮(zhèn)江市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 鎮(zhèn)江212003)

菌種保存方法眾多，選取建立一種保存期長(zhǎng)、占用空間小，簡(jiǎn)便易行的保存方法，使菌種的生命以及生物學(xué)特征得到有效延續(xù)是廣大醫(yī)學(xué)工作者探討的重要課題[1，2]。我院微生物實(shí)驗(yàn)室采用濾紙低溫冷凍法保存臨床菌株，取得了較好的效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌種 金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853，菌株均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.2 臨床菌株 觀察對(duì)象為本室臨床分離菌株，包括銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、白念珠菌等。

1.1.3 菌株保存管 取新華定性濾紙，剪成大小約15mm×3.5mm，放入1.5ml帶蓋塑料離心管內(nèi)，每管1~2片，將離心管編號(hào)，用離心管盒裝載，121℃滅菌30min后備用[3]。

1.1.4 培養(yǎng)基和儀器 營(yíng)養(yǎng)瓊脂、SS培養(yǎng)基、哥倫比亞血平板、麥康凱培養(yǎng)基等培養(yǎng)基由上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；珠海迪爾細(xì)菌鑒定系統(tǒng)及配套的細(xì)菌鑒定條；三洋Biomedical Freezer低溫冰箱。

1.2 方法

1.2.1 保存方法 將室內(nèi)質(zhì)控菌種在血瓊脂培養(yǎng)基上分離純化，用消毒鉗子鉗上濾紙片于平板上刮取，每片盡可能刮取較多的菌苔。放于帶蓋塑料離心管內(nèi)，蓋上蓋子，每菌36管，寫上菌名，置于低溫冰箱的-20℃冷凍保存。對(duì)于臨床日常分離出的陽(yáng)性菌株，先分純目的菌，完成鑒定藥敏操作，然后用消毒小鉗子鉗上濾紙片留取部分剩余菌種，于-20℃冷凍保存，并詳細(xì)填寫保存登記本。

1.2.2 檢測(cè)方法 質(zhì)控菌株：每月取出一支保存管，每周一用無(wú)菌鑷子夾出菌種紙片，在哥倫比亞血平板上輕輕涂抹，37℃培養(yǎng)復(fù)蘇。剩余紙片仍放回離心管內(nèi)，迅速放冰箱冷藏保存。按照室內(nèi)質(zhì)控要求，每周用復(fù)蘇菌種做藥敏質(zhì)控，同時(shí)做生化鑒定，觀察菌株生化特性。臨床菌株：根據(jù)保存時(shí)間的長(zhǎng)短，按照保存期 6、12、18、24 個(gè)月，每個(gè)時(shí)間段分別隨機(jī)從本室保存菌庫(kù)內(nèi)抽取目標(biāo)菌株復(fù)蘇，檢測(cè)細(xì)菌的存活情況，并觀察菌落性狀、菌體形態(tài)，檢測(cè)有關(guān)生化指標(biāo)，比較各菌株的生物學(xué)特性是否發(fā)生變化。包括銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、白念珠菌，數(shù)量均為3株。

2 結(jié)果

2.1 保存期內(nèi)3株標(biāo)準(zhǔn)菌株變異情況 2011年11月起本室采用濾紙法保存的銅綠假單胞菌(ATCC27853)、大腸埃希菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球(ATCC29213)3株標(biāo)準(zhǔn)菌株，定期按照本室的方法進(jìn)行復(fù)蘇使用，至2013年12月底，菌種存活率均為100%。銅綠假單胞菌(ATCC27853)、大腸埃希菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球(ATCC29213)在存活期內(nèi)，細(xì)菌形態(tài)、染色特性、生化反應(yīng)等均無(wú)明顯變化，藥敏質(zhì)控結(jié)果非常穩(wěn)定，說(shuō)明菌株未發(fā)生變異。詳細(xì)藥敏質(zhì)控結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 3株標(biāo)準(zhǔn)菌株保存2年期間藥敏MIC試驗(yàn)結(jié)果與參照結(jié)果對(duì)比(μg/ml)

2.2 7種常見(jiàn)菌株的存活情況 在采用濾紙法保存 的臨床菌株庫(kù)中，從保存期分別為6、12、18、24個(gè)月的菌株中，隨機(jī)抽取銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、白念珠菌各3株。接種哥倫比亞血平皿和沙保羅瓊脂斜面培養(yǎng)基，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h，每個(gè)保存期抽取的21株菌存活率均為100%，菌落形態(tài)特征無(wú)明顯改變且生長(zhǎng)良好。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同保存期7種臨床常見(jiàn)菌的存活情況

2.3 本室臨床菌株保存情況 自2011年11月份本室采用濾紙法保存菌種以來(lái)，至2013年12月31日已保存菌株1300株。臨床分離菌株主要以大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白念珠菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌等為主。詳細(xì)保存情況見(jiàn)表3。

表3 本室細(xì)菌庫(kù)中分離占前10位的菌種情況

3 討論

為了微生物檢驗(yàn)的質(zhì)控工作[4]，進(jìn)行菌株的分子生物學(xué)特征和耐藥性變遷進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以及科研教學(xué)[5]等方面的需要，長(zhǎng)期保存菌株已成為臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的重要工作。菌株的保存方法較多，有明膠片法[5]、磁珠保存法[6]、半固體法[7]、濾紙石蠟法[8]、濾紙法[9]、甘油-生理鹽水法[10]等等，在諸多菌種保存方法中，真空冷凍干燥法效果最佳，但由于設(shè)備要求高，制備程序繁雜、占用空間大等缺點(diǎn)，只適用于保存小批量菌種，如乳酸菌的保存等[11]，并不適合臨床大批量的菌種保存[12]。

我們采用濾紙法保存的菌種，通過(guò)2年對(duì)非苛養(yǎng)菌的觀察，保存的菌株性狀穩(wěn)定，未發(fā)現(xiàn)菌種變異、死亡現(xiàn)象。由于我院檢出的苛養(yǎng)菌數(shù)量較少，未進(jìn)行保存性能觀察。但相關(guān)文獻(xiàn)多提示[9]，用濾紙法保存的苛養(yǎng)菌時(shí)間較短，效果不是十分理想。楊旭等用濾紙法將流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌保存一年后，存活率分別是6/10、7/10，存在一定數(shù)量的菌種死亡現(xiàn)象[13]。而龐璐等以中藥茨實(shí)、山藥作為保養(yǎng)液，用濾紙法保存甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌 、肺炎鏈球菌2年，菌種未發(fā)生死亡，提示濾紙法配合中藥可以提高苛養(yǎng)菌保存周期[14]。

有作者[14]將濾紙條單獨(dú)包裝消毒，保存時(shí)臨時(shí)從包裝內(nèi)取出，這樣做的缺點(diǎn)是多了一道環(huán)節(jié)，增加了污染的可能性，所以我們根據(jù)文獻(xiàn)[15]對(duì)方法進(jìn)行了改良，省去這一環(huán)節(jié)，直接將濾紙條放入離心管內(nèi)，然后進(jìn)行消毒滅菌，應(yīng)用幾年來(lái)未發(fā)現(xiàn)菌株污染的情況。

我們的應(yīng)用體會(huì)是，純化菌株做完鑒定和藥敏，一定要在當(dāng)日保存菌種，如果保存不及時(shí)，細(xì)菌老齡化，一方面容易發(fā)生變異，另一方面菌株容易死亡。至于質(zhì)控菌株，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，可以在購(gòu)進(jìn)時(shí)，將菌種分離培養(yǎng)，用濾紙法分裝3~5年的用量，這樣可以保證實(shí)驗(yàn)室每次使用的都是一代菌，從我們的使用情況來(lái)看，效果非常滿意。

綜上所述，濾紙片低溫冷凍法保存菌種材料簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，操作方便、占用空間小，能避免因反復(fù)傳代而引起的菌種變異，是適合臨床實(shí)驗(yàn)室大批量保存非苛養(yǎng)菌的一個(gè)好方法。

[1]楊應(yīng)虹,羅有福,李子成.抗耐藥金黃色葡萄球菌新藥的研究進(jìn)展[J].華西藥學(xué)雜志,2010,25(4):494-496.

[2]陸貞玉.食品中金黃色葡萄球菌及其檢測(cè)方法現(xiàn)況[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志,2010,26(11):892-894.

[3]干迪郁,任利珍,朱立軍.兩種不同的細(xì)菌菌種保存方法比較[J].中國(guó)鄉(xiāng)村醫(yī)藥雜志,2010,17(1O):49-50.

[4]帥麗華,胡志堅(jiān),孫曉紅,等.臨床微生物檢驗(yàn)質(zhì)量保證和持續(xù)改進(jìn)[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2012,30(5):456-458.

[5]王紅,何曉冬,王典高.明膠片菌種保藏法的應(yīng)用[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2010,37(16):3138-3139.

[6]陳曉 燕,林光.微生物實(shí)驗(yàn)菌種保存方式探討[J].臨床合理用藥,2014,7(10):129-130.

[7]彭俊華,薛榮利,張媛媛,等.三種常用方法保存臨床常見(jiàn)菌種的比較[J].甘肅科學(xué)學(xué)報(bào),2012,24(3):88-89.

[8]文德學(xué),王興林,胡忠惠,等.濾紙石蠟油法保存淋球菌初探[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2013,29(5):698-699.

[9]文德學(xué),顧雪梅,王興林等.菌種濾紙保存法的應(yīng)用[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2013,10(11):1486-1487.

[10]彭孝斌.甘油-生理鹽水保存菌種方法介紹[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志,2014,30(11):933-935.

[11]Fonseca F,Cenard S,Passot S.Freeze-drying of lactic acid bacteria.Methods in molecular biology(Clifton,N.J.),2015,1257:477-88.

[12]白毓謙.微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].濟(jì)南:山東大學(xué)出版社,1986:403.

[13]楊旭,劉曉莉,吳防,等.兩種簡(jiǎn)便保存菌種的方法比較[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2008,5(20):1219-1220.

[14]龐璐,蘇盛通,陳惠業(yè),等.用中藥肉湯保存菌種的研究[J].中外健康文摘,2012,9(36):382-383.

[15]劉金鳳.藥品檢驗(yàn)常用菌種的保存注意要點(diǎn)[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥,2014,9(l1):270-271.