大腸桿菌感受態細胞制備及轉化條件優化

代軍

摘要：針對大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α，以pGM-T、pMD-18T為載體，在傳統CaCl2方法的基礎上，對制備及轉化條件進行了改進和優化，結果表明，42 ℃熱激的最佳時間為100 s，最適冷卻時間為6～8 min。本研究將常規的50 mL離心管改成了1.5 mL EP管，有效降低了分裝過程中可能產生的污染風險，簡化了試驗程序，提高了轉化效率。

關鍵詞：基因克隆;大腸桿菌;感受態細胞;轉化條件;改進;氯化鈣法

中圖分類號： Q-331 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0053-02

收稿日期：2014-11-13

基金項目：國家林業公益性行業科研專項（編號：200904064）。

作者簡介：代 軍（1965—），女，遼寧阜新人，副教授，研究方向為農業生物技術。E-mail：40048601@qq.com。

大腸桿菌感受態細胞的制備與轉化是分子生物學試驗中一項重要的常規操作技術，可用于基因克隆、文庫構建等研究[1]。攜帶目的基因的重組質粒能否導入受體細胞，進而得以復制、增殖、表達，感受態細胞質量及轉化條件是關鍵因素[2]。目前，商業公司可為分子生物學試驗提供各種感受態細胞，但存在價格昂貴、運輸途中容易導致感受態細胞解凍等問題[3-4]。大部分實驗室仍采用經典的氯化鈣法自行制備感受態細胞[5-6]。大腸桿菌菌株DH5α是實驗室常用的宿主菌，常被用于基因克隆、原核表達研究。氯化鈣轉化方法具有操作簡單、重復性好、轉化率高等優點，其原理是Ca2+破壞細胞膜上的脂質陣列，并與膜上多聚羥基丁酸化合物、多聚無機磷酸形成復合物以利于外源DNA滲入[7-8]。不同菌株、不同實驗室環境對于感受態細胞制備及轉化條件影響不同，因此有必要針對特定菌株對其感受態細胞制備、轉化條件進行優化。本研究探討該菌株感受態細胞制備以及轉化的最優條件，旨在為后續分子生物學研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌菌株 E.coli DH5α由筆者所在實驗室-70 ℃保存。載體pGM-T、pMD-18T Vector 購于天根生化科技（北京）有限公司、大連寶生物公司。0.1 mol/L CaCl2溶液所用無水CaCl2為國產分析純。氨芐青霉素（ampicillin）購于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器

HITACHI SCR20BA 高速冷凍離心機，HH-6數顯恒溫水浴鍋，MP 200A分析天平，Eppendorf移液器，超凈工作臺。

1.3 方法

1.3.1 準備工作 EP管、槍頭、槍頭盒、100 mL三角瓶、培養皿等進行高壓蒸汽滅菌，100 ℃烘干，-20 ℃冷凍備用。

1.3.2 藥品配制 0.1 mol/L CaCl2溶液：取1.11 g無水CaCl2，用容量瓶定容至100 mL，分裝置于50 mL三角瓶中，高壓蒸汽滅菌，4 ℃保存備用。100 mg/mL氨芐青霉素（Amp）：取 1 g Amp溶于100 mL無菌水中，分裝至2 mL EP管中，濾膜過濾，-20 ℃保存備用。LB培養基：胰化蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，瓊脂粉14.0 g，溶于950 mL無菌水中，用5 mol/L NaOH調節pH值至7.0，定容至1 L，高壓蒸汽滅菌，分裝至培養皿。

1.3.3 菌種活化 將DH5α菌種在 LB 固體培養基平板上交錯劃線，37 ℃ 過夜培養，獲得良好單斑。取無菌試管加入2 mL LB（不含抗生素）培養基，挑取良好單斑接種于試管中，37 ℃ 搖床培養過夜。按1 ∶ 100的比例，取 0.5 mL 菌液轉接至含有 50 mL LB 液體培養基的三角燒瓶中，37 ℃ 搖床培養 2～3 h，直至 D600 nm 值達 0.4左右[9]。

1.3.4 大腸桿菌DH5α感受態細胞的制備 將菌液分裝至預冷無菌的1.5 mL EP管中，于冰上放置10 min，4 ℃ 4 000 r/min 離心10 min。將離心管倒置以倒盡上清液，用移液槍將倒不盡的上清液吸出，加入1 mL 0.1 mol/L冰冷CaCl2 溶液，立即在漩渦混合器上混勻，冰上放置30 min。4 ℃ 4 000 r/min 離心10 min，棄上清液，倒置1 min，加入1 mL 01 mol/L 冰冷CaCl2 溶液，移液槍輕輕吹打垂懸細胞，冰上放置30 min。4 ℃ 4 000 r/min離心10 min，棄上清液，倒置 1 min，每管中加入60 μL冰冷0.1 mol/L CaCl2 垂懸細胞，冰上放置 2 h，即可用于轉化;也可加入體積分數為40%的甘油，-70 ℃超低溫保存備用[10]。

1.3.5 質粒轉化 將5 μL質粒DNA直接加入100 mL感受態細胞中，手指輕彈管底部混勻，冰浴30 min。42 ℃水浴熱激，設置20 、30、40、60 、80 、90 、100 、120 s 8個時間梯度，設置2、4、6 、8 min 4個冰浴冷卻時間。加入900 μL LB液體培養基（不含抗生素），37 ℃ 180 r/min振蕩培養1.0～1.5 h。取上述轉化混合液100 μL，滴到固體LB平板培養皿（含抗生素100 μg/mL Amp）中，用玻璃涂布棒涂布均勻。正面向上放置30～60 min，待表面菌液完全被培養基吸收，倒置培養皿，37 ℃過夜培養12～16 h[11]。

2 結果與分析

2.1 不同熱激時間對轉化效率的影響

菌種活化時，每隔30 min測1次D600 nm值（表1）。

表1 大腸桿菌DH5α活化后的D600 nm值